【耀文解读】LNP分析方法合集：HPLC-CAD检测mRNA-LNP脂质组分

耀海微生物cdmo

三、使用HPLC-CAD检测mRNA-LNP脂质组分

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于HPLC/UHPLC-CAD法在COVID-19 mRNA疫苗中脂质体检测中的优势，菌菌收集并梳理了近三年相关文献，主题为HPLC-CAD检测LNP脂质组分的方法开发，相关文章汇总如下：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]3.1 默沙东疫苗团队使用UHPLC-CAD检测LNP组分及降解产物

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]篇名：《Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector》

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]这篇文章于2021年12月由美国默克公司（默沙东）发表于《Electrophoresis》，文章主题是选择UHPLC–CAD检测COVID-19 mRNA疫苗中脂质体含量。文章开发了一种可以定量中性和阳离子脂质的UHPLC方法，用于评估LNP中各个脂质组分含量。实验选用Waters Acquity Classic binary UPLC系统，配备Corona VEO RS CAD检测。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]色谱条件为：C18色谱柱，流速0.3mL/min，使用5 μL/50 μL样品环进样自动，柱温为50°C，蒸发器温度35℃。优化后的色谱方法为包含两次等度保持的阶梯式梯度，如下表所示：

图2 HPLC色谱图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]3.2 中检院发表mRNA-LNP脂质组分检测方法：HPLC-CAD

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]篇名：《Validation of an HPLC-CAD Method for Determination of Lipid Content in LNP-Encapsulated COVID-19 mRNA Vaccines》

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]随后于2023年5月，中国食品药品监督管理研究院（中检院）联合赛默飞在《Vaccines》发表文章。研究人员建立了CAD检测器测定mRNA疫苗中脂质体含量的方法，并完成了整套的方法学验证及对实际疫苗样品的测定，结果均表明此方法是可靠的、准确的、无干扰的，适用于mRNA类疫苗中脂质体的安全性和有效性质控（图2）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]这项研究使用了一款mRNA疫苗样品，其LNP组分包括9001（苏州艾博生物）、DMG-PEG2K、DSCP和CHOLE。将mRNA-LNP疫苗稀释后作为检测样品。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]实验使用Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 液相色谱仪，配备Thermo Scientific™ Corona™ Veo™ RS CAD检测器。色谱条件为使用C18色谱柱；流动相A：0.01M 乙酸三乙胺水溶液，流动相B：0.01M 乙酸三乙胺甲醇；流速为1.0 mL/min；柱温为55℃；蒸发温度50℃; 进样体积：10μL。梯度洗脱条件见下表：

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图3 HPLC-CAD分析LNP脂质组分的方法学结果

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]3.3 东国大学基于QbD/DoE开发HPLC-CAD分析方法以检测LNP组分

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]篇名：《Optimization of HPLC–CAD method for simultaneous analysis of different lipids in lipid nanoparticles with analytical QbD》

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2023年9月，东国大学Ki Hyun Kim等人在《Journal of Chromatography A》上发表了上述文章，研究人员基于QbD/DoE方法，使用Plackett-Burman、Box-Behnken、蒙特卡洛模拟等实验方案设计，首先定义了分析目标概况（ATP）和关键方法属性（CMA）的标准，随后依次完成了关键方法参数（CMPs）的识别和优化、预测并验证了最佳响应值、形成分析方法设计空间（MODR），最终建立了稳健的HPLC -CAD方法以用于LNP检测。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]实验选用Thermo Scientific Dionex Ultimate™ 3000液相色谱仪，配备Thermo Scientific™ Corona™ Veo™ RS CAD检测器。最佳方法条件如下：使用C18色谱柱；自动进样器温度为20℃；流动相为甲醇：水(96：4，含7.5 mM甲酸铵); 流速1.2m L/m in; 进样量20μL，柱温65℃，蒸发温度50℃。得到如下所示的色谱图。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图4 HPLC色谱图

今年4月30日美国药典USP发布的“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality”2.0草案中明确写明脂质表征和含量测定使用CAD检测器。本文总结梳理了近三年来关于HPLC/UHPLC-CAD检测mRNA疫苗中脂质体含量的方法，所有实验均完成了整套的方法学验证及对实际疫苗样品的测定，结果有效地证明了此方法的可靠、准确性，可适用于mRNA类疫苗中脂质体的安全性和有效性质控。四、耀海生物mRNA分析方法开发及检测服务

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为满足mRNA-LNP的方法开发和检测需求，耀海生物建立了适用的UHPLC-CAD分析方法，4种LNP组分实现基线分离，成功实现脂质组分的鉴别。各脂质组分定量检测线性结果显示，R2均大于0.99。该方法具有很好的重复性。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图5: LNP脂质组分鉴别与检测：耀海平台UHPLC-CAD

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海生物质量研究服务平台，目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质；mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA（dsRNA）、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关杂质；LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量，可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测，全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）