多肽/蛋白质中氨基酸组成的柱前衍生高效液相色谱法分析

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氨基酸（Amino acid）是一种小分子的两性化合物，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，是构成多肽/蛋白质的基本单位，赋予其特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。氨基酸组成分析是多肽/蛋白质化学研究中最基本的内容之一。通过氨基酸组成分析可以初步了解多肽/蛋白质的化学结构特点，以及某些特征活性氨基酸的分布情况，为多肽/蛋白质结构与功能的研究提供科学的信息。ICH Q6B指南要求测定蛋白质药物的氨基酸组成，在必要的情况下将测定结果与预期产品或天然品根据基因序列推导的氨基酸组成进行对比，根据结果可以推算出蛋白含量的可靠值。

随着高效液相色谱仪的发展，使用高效液相色谱技术分析氨基酸获得了迅速发展。由于高效液相色谱方法无需特殊反应装置, 具有高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点，已在许多实验室部分或全部替代了氨基酸自动分析仪，被广泛应用于多种生物样品中氨基酸的检测。

实验原理

      进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸。水解后的混合氨基酸样品需进行衍生，常包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法。不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。

　　由于衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定。由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定的产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定。在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。

应用案例

某单抗样品使用6M盐酸进行酸水解成游离氨基酸，然后用PITC对游离氨基酸进行柱前衍生化处理，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。衍生化反应结束后加入正己烷混合静置，吸取下层液体样品经反相高效液相色谱分离后用紫外(254nm) 进行检测。此法简化了实验步骤，既节约了时间，又降低了费用。本方法的线性浓度范围约为25～2500 pmoL/μL，不同氨基酸在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。各氨基酸峰间的分离度均大于1.0。

小结

氨基酸组成分析可以测定多肽/蛋白类生物药物的氨基酸组成及含量，可以在一级结构水平对其进行宏观表征，初步确定蛋白的表达是否正确，对评价生物药质量具有重要意义。应用超高效液相技术平台，通过氨基酸水解柱前衍生法检测已成为生物样品中氨基酸组成分析的黄金标准。

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