ELISA实验问题

圆11

各位蒲友，我最近做ELISA实验遇到了一个问题，半个月了一直没解决掉，想来咨询一下大家的意见。
这个实验是用来检测公司生产的单抗的结合活性，包被商业购买的对应抗原，二抗是过氧化物偶联的羊抗人二抗，之前实验一直没问题，从某一天开始，就出问题了，梯度稀释的样品没有显色差异，而且空白对照也显色，后来不加样品，包被封闭完成后直接加二抗，也显色，总结就是，只要包被了抗原的地方都会显色，不包被被封闭了就不显色。然后我们做了如下探究：1、换了几只新包被抗原以及不同厂家的抗原，没有效果；2、样品稀释液换了几种，没有效果；3、封闭液换了两种，没有效果；4、二抗换了厂家，没有效果。以及所有试剂都重新配制过好几次了，现在感觉找不出原因在哪里，还希望蒲友们能够提供帮助，能帮忙找到原因的，必会感谢。劳烦大家帮帮忙，谢谢。

猫咪特工

关注一下

张寅

用我不太专业的角度来看

我觉得您的封闭液应该没问题，不包被抗原，只用封闭液，是可以封闭住的，后面无论加的是您的单抗，还是二抗，都被洗走了，所以没有显色。

就是让人很奇怪，有种像是抗原可以直接和二抗结合的感觉，但您换过抗原，又换过二抗，所以比较头疼。我再去咨询咨询其他同事。

仅供参考

张寅

“后来不加样品，包被封闭完成后直接加二抗，也显色” 从这个信息觉得您的抗原和二抗有结合。

不知道您换的抗原和二抗，只是换了厂家还是连类型也换了，如果没换过类型，可以试试换下其他类型的二抗，先试试看抗原和二抗，他们不结合，再做实验看看。

圆11

张寅 发表于 2022-05-29 11:32
“后来不加样品，包被封闭完成后直接加二抗，也显色” 从这个信息觉得您的抗原和二抗有结合。

不知道您换的抗原和二抗，只是换了厂家还是连类型也换了，如果没换过类型，可以试试换下其他类型的二抗，先试试看抗原和二抗，他们不结合，再做实验看看。

类型没有换，都是同样的东西，但是如果二抗本身与包被抗原结合的话，最开始做了也十来次实验，都没问题，就显得有些奇怪。非常感谢您的帮助。

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张寅

圆11 发表于 2022-5-29 15:18
类型没有换，都是同样的东西，但是如果二抗本身与包被抗原结合的话，最开始做了也十来次实验，都没问题， ...

不知道您最开始做的实验用的二抗的批次，和后续不正常结果用的批次是否一样

如果一样，实在想不通

如果不一样，倒是有可能

我们做WB，以前都好好的，去年用新的一批一抗，结果就不行了，总是会和Marker结合，问过以前的老同事，他说他也碰到过，换一个批次的一抗就又好了。

毕竟抗体是从动物体内获得的，碰到特殊的产品，也可能会有差异吧。

圆11

张寅 发表于 2022-05-29 16:15
不知道您最开始做的实验用的二抗的批次，和后续不正常结果用的批次是否一样

如果一样，实在想不通

如果不一样，倒是有可能

我们做WB，以前都好好的，去年用新的一批一抗，结果就不行了，总是会和Marker结合，问过以前的老同事，他说他也碰到过，换一个批次的一抗就又好了。

毕竟抗体是从动物体内获得的，碰到特殊的产品，也可能会有差异吧。

二抗是同一支，没换过，就非常想不通了。计划换个人做一下，看看是不是操作出问题了，真找不到原因了

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时兵哥哥

显色液的问题

时兵哥哥

TMB显色液的问题

圆11

时兵哥哥 发表于 2022-05-30 12:23
TMB显色液的问题

显色液没有问题呢，其他实验也在用同一瓶，没问题的

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张寅

圆11 发表于 2022-5-30 08:07
二抗是同一支，没换过，就非常想不通了。计划换个人做一下，看看是不是操作出问题了，真找不到原因了

后续如果有结果，能分享的话，记得分享下结果

你好2021

是污染了么？

青麟

没有效果是啥意思，所有试剂更换过都一样无差别显色？
之前实验一直没问题，从某一天开始，就出问题了
同样的试剂，同样的操作，不应该出现这个问题，如果抗原能跟二抗直接结合，那一开始的实验就不会成功才对。
并且更换各种试剂后，依然发生相同情况，另外你也没提到标准曲线做的如何？