免疫层析平台-胶体金和彩色微球的差异

xy952019898

不同标记物的差异

xy952019898

免疫层析诊断试剂是根据免疫学原理、利用大孔径微孔滤膜为载体、通过固
相标记物来定性、半定量或定量检测样本中待测物质含量的一种侧流快速检测技
术。由于其最符合WHO关于理想诊断试剂ASSURED（见附）的标准，自80 年
代末、90 年代初以来已经得到了很大的发展。表现在：1.检测项目越来越多；2.
检测范围越来越广； 3.检测样本种类越来越多；4.标记物种类越来越丰富； 5.
检测灵敏度越来越高； 6.从单一检测发展到多元检测； 7.从定性发展到半定量、
定量检测。勿容置疑，提高检测灵敏度、定量检测以及多元检测是免疫层析技术
发展的三个方向。尤其是检测灵敏度不高是限制免疫层析诊断技术发展的最主要
技术障碍。但三者的发展均与标记物的发展息息相关，因此，可以说，免疫层析
诊断试剂的发展主要表现在标记物的发展上。没有标记物的发展，多元检测、灵
敏度的提高以及定量检测都不可能实现。在免疫层析诊断试剂中，理想的标记物
应具备以下条件：
1．灵敏度高；灵敏度一般要达到ng级，甚至pg和甚至fg级，而且标记物容易被
简便快速、价廉的检测系统检测到。
2．结合特性好； 标记物应不影响抗体或抗原的免疫活性、亲和力和特异性，
不减少免疫反应信号的产生。另外，标记和纯化的方法比较简单。
3．均一性好，制作方便；
4．稳定性好； 标记物必须对样本中的可能影响物质，如、酶类、有色物质、
淬灭物质等不敏感，才能保证标记试剂在较长时期内的稳定储存，减少批间
和批内差。
5．环境因素的不敏感性； 标记物对环境中的光、温度以及样本中缓冲液、温
度或PH等变化不敏感。
6．安全性好；标记物必须无毒、安全、无危险、无废物处理问题。
7．应用性好；标记物必须来源方便，标记反应温和，容易得到理想结果和重
复性好，能广泛应用于临床和研究

xy952019898

一、酶
在免疫层析诊断试剂的开发早期，酶的使用最广泛。由于早期试剂装置比较
简单，酶和底物溶液仍然需要在 4℃保存，无法达到一步法，导致产品使用步骤
多，产品运输和储存需要冷链，逐渐退出研究者的视线。但由于酶具有信号放大
作用、灵敏度高，在检测高致病生物时，用处较大，最近又重新进入研究者的视
野。尤其值得一提的是，由于试剂装置的改近，现在几乎已经可以达到一步法。
如下图的反方向免疫层析装置，其将底物装入底物池储存池（有的还设计有洗涤
液储存池），加入样本后，用力按压使底物池储存池破裂，从而释放底物参与反
应。目前使用的多为 HRP 和 ALP。 图 日本Fujirebio设计的酶反应装置图
图 日本Fujirebio测定SARS-CoV产品实物图
优点：
1．检测灵敏度高；如使用ALP检测IgE 0.2 U/ml，胶体金法为4 U/ml，灵敏度提
高20倍。检测SARS-CoV N抗原灵敏度可达31pg/ml。 2．标记方法成熟。不仅可以标记生物大分子，还可以标记小分子。在检测小分
子时可以不需要制备小分子-蛋白载体结合物，可以采用标记抗原，包被抗体
的方法。这样可以降低试剂的生产成本，小分子-蛋白载体的成本经常是超过
相应抗体的成本。
3．检测仪器成熟、简单价廉。需知采用荧光标记的检测仪器对电源需求有的高
达1000V。
缺点：
1．检测范围窄；为102
-103。 2．检测受温度影响较大，限制其在现场的使用；
3． 由于底物仍然为液体，产品有效期短。

xy952019898

二 胶体染料


优点：
1．价格便宜；这是文献中强调最重要的原因。常用为纺织工业染色所用的染料，颜色多样，常用的为红色和蓝色，有利于多元检测。通常以数公斤的规格销售购买，而每克即可以制备数万份试剂，因此其成本可以忽略不计。胶体金的成本一般为 1-2 分人份（5 毫米），彩色乳胶为 1 角左右。
2．标记方便；一般是通过物理吸附，少数是化学交联。因为其对 pH 的依赖程度不高，但其对离子强度要求比较高，一般不可以超过 15nM，否则将破坏胶体的稳定性，导致胶体染料的不可逆沉淀。
3．稳定性好。标记好的胶体染料可 4℃保存，也可以—20℃保存，也可以反复冻干保存，其活性基本不变。而胶体金一般 4℃保存 3 个月，绝对不可以—20℃保存，但可以在保护剂的作用下冻干保存。

缺点：
1．检测灵敏度不高；虽然在统计学上与 EIA 相当，但仍然比胶体金低。
2．市售的胶体染料颗粒不均一，使用前需要反复溶解离心去处过小的颗粒（20，000g，30m 去上清四次）和过大的颗粒，动力消耗过大，比较费时；
3．由于每种胶体染料的抗体吸附特性不一，因此需要对染料进行筛选；
4．蛋白标记用量一般是通过半产品的性能确定，即通过检测线颜色深浅与膜背景的深浅来确定，不如胶体金标记时用 NaCl 确定方便；
5．标记原理的通过物理吸附，标记时间比较长，一般要 1h，而胶体金一般为15-30m。

xy952019898

三 胶体硒[

由于只有 Abbott 研究胶体硒并有相关专利保护，因此使用人较少，相关比
较文献很少。在免疫层析中使用的粒径在 80nm 左右。
优点：
1．制备容易；与胶体金一样在 15m 内既可完成。
2．标记方便；主要是通过疏水作用和静电吸引。尤其在标记重组蛋白和其它胶体金难标记蛋白时要相对简单。
3．检测灵敏度高；但与胶体金无数量级的区别。
4．检测范围在 5×103。

xy952019898

四 胶体碳

在免疫层析中，常使用的颗粒为 100-200nm，与彩色微粒的颗粒相当。

优点：
1．检测灵敏度高；尤其是在定量检测中，灵敏度比较高。如检测E. coli O157:H7，
检测灵敏度在2×102CFU/ml，胶体金一般为105CFU/ml，彩色微粒为104CFU/ml。这是因为黑色的胶体碳颗粒在白色的膜上颜色对比最明显，黑白分明。使用CCD技术扫描定量检测，胶体碳产生可检测到的灰度需要0.2ng/mm2 (0.1 amol/mm2)，220nm的蓝色微粒颗粒需要25 ng/mm2。故而在灵敏度要求较高的致病生物检测中，常使用胶体碳。
2．制备方便；一般是将购买的碳粉超声粉碎即可，比胶体金的制备方便。由于碳粉可以大量生产和购买，这样可以避免批件差异。如果考虑到原始工厂的生产，胶体碳的生产在所有标记物中是最简单方便的。
3．价格便宜；
4．稳定性好；标记好的结合物4℃可以保存至少一年。
5．定量检测可以使用简单的CCD技术扫描技术，仪器成本低而灵敏度高；
6．检测范围为103，比胶体金102高。
缺点：
1．标记原理为被动物理吸附，标记时间比较长，一般为 3h 吸附，3h 封闭。其标记原理同胶体金标记一致，即标记 pH 为 pI+0.5，最低保护量可以通过 NaCl的制凝现象来摸索。
2．颜色仅有黑色，不利于多元检测

xy952019898

五 胶体金
目前，商品化的试剂中 90%的产品采用胶体金，2/3 以上的文章采用胶体金。
关于胶体金在免疫层析中的应用拟以后详细叙述。
优点：
1.制备方便；
2.可见性好；
3.特异性强；
4.稳定性好；
5.标记容易。
缺点：
1.仅一种颜色；
2.灵敏度不高；检测细菌在 105CFU/ml，病毒 105-107个/ml。在检测蛋白在 1ng左右。
3.不能共价交联；
4.制备重复性差；
5.定量范围窄，在 102。 6．Ig2b、尤其是 Ig3 标记困难。因为其含有多个硫原子的，由于它能通过配位键使胶体金交联起来，从而导致胶体金凝集沉淀。以上缺点限制胶体金的应用尤其是在定量检测中的应用，虽然最早定量检测
cTnI、cTnT 是采用胶体金，但以后均不采用胶体金

xy952019898

六 彩色微球
世界上第一个商品化的免疫层析试剂盒是于 90 年左右美国Unipath开发的采用彩色微球标记的ClearviewTM早孕试剂。由于受当时彩色微球颗粒比较大，很难找到适合免疫层析技术适用的彩色微球。经过十年的发展，目前世界上已经有
许多厂家能够生产出符合免疫层析技术需求的彩色微球。

优点：
1．检测灵敏度高；由于在免疫层析中所采用的彩色微球的粒径要比胶体金大 10倍，所以采用彩色微球标记，灵敏度会提高 10 倍左右。
2．色彩丰富；有利于多元分析及在 OTC 产品上的使用。
3．标记方式多样；由于通过不同的生产工艺，可以生产出具有氨基、羧基、巯基等带有不同官能团的彩色微球，所以，彩色微球的标记既可以采用被动的物理吸附法，也可以采用共价的化学交联法。对于含有多个硫原子此类分子，采用彩色乳胶标记会取得良好的效果。
4．批间差小。因为彩色微球可以大规模的生产。
胶体金和彩色微球的比较
特性 胶体金 彩色微球
可见度 极好 极好
颜色 一般，仅红色 极好，很多颜色
多元检测 一般 极好
灵敏度 好 极好
稳定性 极好 好
制备难易程度 极好 好
制备重复性 好 极好
扩大生产 好 极好
标记方式 物理吸附 物理吸附，共价结合
标记难易程度 容易 稍困难
纯化 容易 稍困难
成本 便宜 稍贵
缺点：
1．定量分析比较困难。主要原因是彩色微粒在捕获线上凝集时，其色度不均一，
其边缘的色度一般比中间高，这样通过 CCD 法检测灰度时，取点要求比较多
以避免产生大的测定误差

xy952019898

有机荧光分子
有机荧光分子是一类可将高能量激发光转化为低波长的发射光的物质。目前，在已商品化的定量免疫层析诊断试剂中，荧光分子应用最多，可以分为三类（时间分辨荧光法中的镧系元素因具有其特有的性质，故不划为此类传统的有机
荧光分子）：
（一）有机荧光分子
有机荧光分子的标记是通过化学交联，虽然其种类很多，但多数有机荧光分子产生的信号低、或不稳定，因此在免疫层析诊断试剂中常用的为 Alexa Fluor 647、Cy-3、Cy-5 等三种。
优点：
1．分子阻碍小；与大颗粒标记物相比，有机荧光分子很小，标记后一般不会因为空间位阻而影响免疫反应。
2．检测灵敏度高；如采用 Alexa Fluor 647 标记，利用定量竞争法检测微囊藻素，其检测灵敏度可以达到 50pg/ml。
3．特异性高；与大颗粒标记物相比，有机荧光分子小，标记后不会凝集，与 NC膜的非特异吸附低。
4．可以标记小分子，以利于小分子的检测及降低生产成本。（见酶之优点）
缺点：
1．化学交联标记可能破坏某些有机荧光的发光特性；
2．不同有机荧光其标记方法不同。

（二）荧光微球
荧光微球的本质同彩色微球一样，它是将有机荧光分子掺入或包被乳胶微球而制成。
优点：
1．检测灵敏度高；如采用荧光微球标记，检测 E. coli O157:H7 ，其检测灵敏度为 1000CFU/ml；检测 IL-2 ，其检测灵敏度为 2 pg/ml。比采用胶体金标记灵敏度提高 100 倍。
2．检测范围比胶体金稍好，但无数量级之差异；如 Biosite 公司开发的 B 型促钠排尿激素试剂盒在 5pg/ml 到 1300pg/ml 内具有良好的线形范围。采用胶体金标记做定量分析，检测范围只能在 100 之间。
3．批间差异小；因为荧光微粒可以程序化、规模化生产从几十到数百升的工业化生产。
4．标记方便。既可以通过物理吸附，也可以通过化学交联，还可以利用配体与受体之间的相互作用（如链霉素-生物素）。
缺点：
1．分子阻碍大；
2．特异性低。因乳胶微球容易凝聚

（三）有机荧光分子-葡聚糖结合物
有机荧光分子-葡聚糖结合物是将有机荧光分子通过化学交联至葡聚糖的长链状结构上而形成的一种荧光标记物。与常规的有机荧光分子相比：
优点：
1．检测灵敏度更高；通过葡聚糖链，每个被标记物能够标记更多的有机荧光分子，而通过直接标记，每个被标记物能够标记的有机荧光分子有限。另外，由于有机荧光分子能够分布在整个葡聚糖长链，这样有机荧光分子之间的距离比直接标记要远，从而降低了有机荧光分子的淬灭。
2．稳定性更好；因为降低了有机荧光分子的淬灭。
3．即可定量检测也可以定性检测；由于葡聚糖上能够结合大量的有机荧光分子，其发出的光信号肉眼可见，因此可以定性检测，但其检测灵敏度与胶体金标记相同。如用荧光仪定量检测，其检测灵敏度比胶体金高 10-15 倍。

xy952019898

目前我使用过胶体金  、彩色微球、 荧光微球

胖头鱼123

谢谢楼主分享，学习一下

xy952019898

不要下沉了啊   有做体外诊断的同行呢

黄晓晴

谢谢楼主分享

y1g2p3

谢谢分享！先学习学习！