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本帖最后由 朱小美 于 2016-7-10 22:12 编辑
我和微生物的不解之缘 作者：阿郎 来自蒲公英小一班微信群分享，转载请与作者联系
微生物，脑海里好熟悉的名称，肉眼看不见、摸不着，但一定是存在，大量地存在，无所不在，无法计数，无孔不入，“无法无天”（疾病菌危害大）。之所以觉得有缘，因为从小到大的生活、学习、爱情、工作、梦想都和微生物有很多不得不说的故事。写这文章，纯碎天马行空地瞎想，想到哪写到哪，偶而“拌”点微生物专业知识“酌料”，纯属“皮毛”分享。
一、我的童年 我是农村长大的孩子，现在回想小时侯，有很多生活经历是和微生物有关的，虽然那时不懂什么是微生物。比如为了吃到咸菜，农村里家家会有腌“咸菜”的习惯，大人把成熟的“卦菜”洗干净，晒到半干，再一棵棵放到干净的大坛子或水缸里，加入上一次坛子里的液体做发酵引子，用脚去踩软，加入盐用手拌均，盖紧盖子，腌个2周就可以打开，最后成为餐桌上的咸菜；有时也会腌青菜根，小孩子没得吃，就会剩大人不在家，偷偷从坛或缸里去挖出“菜根”，剥去外皮后吃得津津有味，没有零食吃的年代，那就是美味佳肴。回想，那发酵引子应该就是各种各样的微生物组成，有细菌也有真菌，再加上脚踩（干净不予评论），味道真是奇特无比。
又比如，农村里也有自家做豆豉（一种餐桌上咸酌料），就是黄豆下来后，晒干的豆子先煮熟，放在一个潮湿房间内让豆子发酵长出毛绒绒的毛，再放到坛子里加盐再次发酵4周以上，就成了棕色的豆豉，半固体半液体，用于配饭或粥用。那毛绒绒的毛应该是微生物中的真菌了，坛子里是再次发酵的过程。还有豆腐乳，也是微生物发酵产品。 小时候一到春夏季节的下雨天气，可上山采到各种野磨菇，应该是大型的真菌了。普及一下，大型真菌，因菌体大而得名，包括各种食用菌和药用菌，如蘑菇、木耳、灵芝、猴头菌、茯苓等。
另外，农村很多人家盖的沼气池，用各种人或生畜排泄物、农作物秸杆做原料，在厌氧（没有氧气）经发酵分解转化产生的沼气，主要成分是甲烷和二氧化碳，用于家里的烧火煮饭或供热水，也是和微生物有关。还有微生物不好的地方，比如隔顿吃的粥或菜会馊坏掉，当时还没有冰箱之类的可以冷藏，吃过好多次的馊饭，也是记忆尤深。想想，当时的胃肠道菌群一定功能强大，现在再吃肯定闹肚子，农村有句土话叫“不干不净，吃了没病”。我们人体肠道内微生物是一个完整的生态链，分“好菌”和“坏菌”两大阵营，闹肚子就是“坏菌”繁殖过多占了上锋，所以，平时多吃点酸奶或双歧杆菌等相关饮品是补充“好菌”，应该是有些好处的。
二、我的学习 顺着成长经历往下走。真正知道“微生物”这标准的说法，应该在中学课本的“生物”，讲到食物链从顶端直到底层，最下面就是数量众多的微生物了。“微生物”是指一大类形体微小、结构简单，大多数是单细胞，必须用显微镜观察形态的低等生物的总称。保持生态系统的正常运转，没有微生物简直是不可想象的。人死了，动物死了，植物死了，没有微生物的分解有机物和转化代谢，那到处是尸体，整个地球不堪重负也将灭亡。教科书里，关于微生物的分类，一是原核生物，如细菌（又分球菌、杆菌和螺旋菌三种）、支原体，二是真核生物，如霉菌、单细胞藻类，三是非细胞生物，如各种病毒。微生物，让所有衰老死亡的生命，最终都走向“尘归尘，土归土”，“从哪儿来，回哪儿去”，保证大自然的正常生态偱环。想想自已哪天死了，虽伦不到微生物的代谢腐化，先把有用器官捐掉，没用的经高温火化后就是一把灰了，撒到老家的山上或是成为种花种树的肥料，这也是微生物的丰富养料。 到了大学，我学的专业是“微生物制药”。老师说“二十一世纪是生物学的世纪”，现在回想起，学生物的学生是否有点上当受骗的“赶脚”。几乎一夜之间，全中国的大学都有“生物学或生物工程”这门专业，但生物专业就业形势并不好，到现在也没看到生物药在中国有非常乐观的前景和美好蓝图。大一课程，从最基础的“微生物学”开始，到“抗生素发酵、分子生物学、生物技术”等一系列生物相关的课程；微生物试验，从配培养基、接种、菌种保藏、传代、斜面培养、倒碟、无菌操作、抗生素效价测定、病毒噬菌斑测定、摇床培养、革蓝氏染色（阴性或阳性）、生化鉴定、显微镜或高倍电境观察、紫外辐照让微生物变异等很多的操作，也垫定了“微生物制药”本专业的基础。“无菌操作”是大学必练的操作基本功，在一般的普通环境下，怎么能做到接种不会污染进杂菌微生物，一遍一遍地练，没有B/C级洁净背景，没有A级层流的超净工作台或生物安全柜，没有几层的洁净衣包裹，仅有一个酒精灯或煤气喷灯，一个接种环，不管是液体菌液还是斜面菌管，硬是要练成接种到另一培养碟不能染杂菌，一定要考试过关，四年大学，要培养出“无菌意识”的基本功，“钢铁是怎么练成的”，“万里长城也不是一天建成的”，还在于日积月累、刻意训练的结果。你的一点不规范动作都是影响染菌的因素之一，例如接种环是否烧得通红通红完全无菌、打开棉塞的速度要快，不能沾到桌面，迅速接菌株、开培养碟上盖的口不能太开也不能太小、接种上目标菌并涂抺均匀等，都是高超的“技术活”，容不得你半点的不认真。
曲苑杂谈，就说说微生物实验的二三趣事.......。
先说说培养基，培养基配方非常多，无非含有微生物生长所必须碳源、氮源、无机盐、水分、生长因子（如包括维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等），但大类上就是二种状态的，一是固体，二是液体，里面有蛋白胨、牛肉浸膏、肉汤、骨头汤，还有血培养的小牛血、细胞因子、抗生素、糖类、无机盐、磷酸盐、酸碱等，就是要创造一个适合微生物成长的最佳营养环境，让目标菌成长、让杂菌或其它菌抑制甚至不长。而培养基特有的味道，也是很多实验人员适应不了的，开始配制时有微“香”，灭菌后“香味”更浓，当然有些人觉得是“臭”的，甚至做呕，而发酵时期的培养基，从微生物迟缓期、对数生长期、稳定期（平台期）到最后的衰亡期，培养基味道随着营养成份的消耗殆尽也在发生变化，最后出来的发酵液确实“臭”的不是一般人能长期忍受的。“既来之，则安之”，因为你是来做试验的。
我的大学生活，也有因微生物实验享受“福利”的时候。做毕业课题那时，同一实验室有一同学在做“酸奶”的试验，每天上午都能享用到他前几天的处方成果，今天是双歧杆菌（一种厌氧性微生物）的不同辐射菌种发酵的，明天是牛奶、糖、不同酸碱的不同配方培养基发酵的，还有不同发酵温度、时间长短、后加不同香精味道等的筛选，学生时代对物质饥渴的感受，只觉得天天能喝到“酸奶”是一种莫大的享受，深深烙在你大脑记忆的最深处，大学是用来回忆的最纯真、最美好的一段时光。
说到微生物试验，手动式的灭菌锅也是必备试验“武器”之一，于是干脆扯得更远。我们那时候大学的食堂伙食不敢恭维，于是，也不知道是谁的创意，在晚上做试验时间，用灭菌锅来压从市场上买回来二块钱的鸡架（鸡去掉肉后的骨头架，吃得是没去完全余下的肉），事先加点实验室的氯化钠，因为 121度的高温高压后的肉奇香，对于没肉吃的学生们来说这就是“美味佳肴”。于是，在吃着灭菌锅压后鸡架的同时，脑海中也印下了保证无菌的灭菌条件是：湿热高压灭菌 121℃、30min。制药生产活动中，高压灭菌常用的压力为 103.42 KPa，温度为121.5℃，维持15～30分钟，可杀死包括细菌芽孢在内的所有微生物。还有一点得记住，含葡萄糖和氮源的培养基不能采用121℃灭菌，因为二者在高温下会发生 美拉德反应，会让糖碳化，培养基的营养成份丢失，培养基颜色明显加深，所以，选用的灭菌条件是：115℃ ，15min或者20min。
接着聊微生物，菌种来源也是最关键的。大三放寒假，系里又布置了收集各地方的土壤样本，以便能发现到新的微生物。因为我们“微生物制药”两个班的都来自全国各地，除西藏外都是有同学的，大家回到自已家乡，需要采集至少三份以上的土壤样本，一是较肥沃土地里的，二是较潮湿的树林或森林里的，三是较贫脊的沙地或红土壤，用密闭容器或袋子贮存好，避免干掉。回到学校后，自已把土壤样本进行溶解过滤掉沙土，取滤液分25度（真菌）和37度（细菌）两种条件进行培养基培养，最终挑选有代表性或特殊菌种进行分离再增菌，最终还是有几个同学筛到学校菌种库内没有的菌株，也算是大家为学校及未来的师弟师妹们做点有益的事。
再来说说我的毕业课题，也是和微生物有关的。记得当时做的题目是“超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化”，回想应该就是和后来响切大江南北的“大宝SOD蜜”一样一样的化妆品的主成分。先是查找相关文献资料，在学校新图书馆按文献检索索引把所有中外科技专刊都找了个遍，整理出所有有SOD或同类酶类的分离纯化文章，找到相关纯化步骤和检验方法，再设计出本课题的分离纯化步骤和所要采用的检验方法。带课题的老师给了菌种，是酵母菌的一种，SOD是它的胞内产物，需要设计几个紫外辐射不同时间的方案，以筛出表达量最高的菌株，辐射后的酵母菌通过斜面的增菌，把第一代菌以甘油管方式先保存原始的菌种（这是成功后的革命火种，不能丢失或保存不当），余下的斜面菌就可以接种到稚形瓶的液体培养基中进行摇床扩菌了，几天后当菌量为最大时且处于成长平台期时，可以从摇床撤下到离心机上进行菌种收集，离心机的底部是乳白色一大片菌体，汇总所有菌体后按克数比例加破壁酶，让SOD酶充分从胞内出来，又是白哗哗的一片液体，取检测量的样品加显色剂到紫外分光光度计测定吸收值的变化，以测定单位体积数的效价，因为测定时需要避光，只能在黑屋子里拿个手电筒照一下测定的数值，后面又有上阳离子交换柱等纯化步骤，泡在实验室里没白天没黑夜的，最后终于筛出一个较高表达量的紫外辐射菌株，想想还是“蛮拼”的，没有白费三个多月的努力付出。回头想想，“大宝SOD蜜”卖得那么“火”，老师错过了，我也错过了。。。
三、我的爱情 文章说回重点，这段是小一班老大张金巍让选题分享时我当时的初衷：我在学校的无菌室写“情书”，收获了同班同学的爱情，后来成为了我老婆。大学通常的情节：毕业季即分手季，我们有点反渠道而行。我可能比较晚熟，学习也没在班里前列，我老婆是班里的学习委员，也是最早的一批入党积极分子，我们之间擦出爱情的火花应该不大可能。我对她是有好感的，学习上进勤奋，思想相对独立成熟。大四下学期，大家都在确定在哪做毕业课题或是学习单位，那时我老婆和班里及系里的部分班干部获得优先机会能到西安某一药厂进行实习。走前的一天，我老婆、她同一省的老乡（我同宿舍兄弟）和我晚饭后一起到学校旁边的陆军总院的荷花池去散散步，我鼓起勇气对她说，“你去西安，我能给你写信吗？”，她点点头。在学习的三个半月，我每周给她写一封信，一共14封，这可能也是之后我们能够结合组成一个家庭的主要动因。毕业做课题是很枯燥的，写信就成了我交流的动力。因为没有更安静的地方，我选择了在自已天天做实验的“无菌室”内写信（这种做法不推荐啊！被老师或学校处罚者自行负责），不受打扰。每次写信前，先把实验后的无菌室收拾得干干净净，放进信纸和笔，用室内的紫外灯照上半个小时，然后进去前关掉紫外灯，安静在里面写信。写信和看书一样，都需要仪式感，会让你感觉脑袋放空，一尘不染地纯净，是真得“无菌”。微生物、无菌室，也许冥冥之中就是我俩的“红娘”，我们也是班里唯一有成的一对，生活就是这么的有意思！
四、我的工作 参加工作后，还得讲一讲和微生物的故事。
我工作过的前两家单位，曾参与过两个国家一类新生物制品的新药开发，产品均为微生物表达的重组类基因工程产品。第一家单位开发的是抗凝血类的重组产品，有一段时间我和技术转让单位一起到山西大学生物工程学院进行发酵表达，吃住在学校，天天想着怎么提高表达量，最终这个产品还是因为技术人才缺乏、无法技术突破而无疾而终。第二家单位也是和中国空军总医院合作的另一个抗肿瘤重组类项目，产品已上二期临床，但超过50%的用药人员有体温升高的副作用，也是技术无法解决，最终中断合作。回想老师说的“二十一世纪是生物学的世纪”，1997年至2007年期间国家在生物药开发资金投入确实巨大，“烧钱”的时代并没有得到应有的高回报，当时的干扰素、EPO等“重磅炸弹”类产品红极一时，最后还是因疗效不确切而走向没落，所谓“理想很丰满，现实很骨感”。
到了现在的单位，我做过两年的 QC经理。接触了无菌和非无菌药品的生产和检验工作，具体操作我没有做过，只是在做产品放行和微生物异常调查时会碰到微生物问题。概括起来，主要涉及GMP洁净区管理、微生物知识培训、微生态制剂、非无菌药品微生物检查、无菌产品的无菌检查、水微生物检查、环境监测沉降菌、浮游菌、表面微生物检查等。实施GMP最主要出发点是防止混淆、差错、污染和交叉污染，而污染和交叉污染的来源是微生物和尘粒，所以，洁净区的软硬件规范管理就非常重要，特别是无菌车间的无菌保障是第一位的。微生物污染是影响生产环境最重要的因素，它与最终的产品微生物负载控制相关。单一微生物本身并不能独立存活在空气当中，一种以菌团形式存在，另外一种附着于无活性的尘埃粒子(直径大于0.5μm的粒子)之上。
而人，则是洁净区内的最大污染源，人的呼吸、毛发、皮肤、衣物每分钟都散发着大量的微生物。对人员的管理，GMP有如下条款：进入生产区操作的人员必须是经过健康检查合格的人员，传染病患者，体表有伤口，及药物过敏者不得从事直接接触药品的生产；生产人员每年体检一次；不得留长指甲，做到勤洗手、勤洗澡、勤理发、勤换衣服、刮胡须，保持个人清洁。人的身体上，九成是微生物，人体内滋生着成千上万种细菌，有些细菌喜欢生存在人的腋窝处，其余的则喜欢寄居于人体其他相对干燥的部位，如每1平方厘米面积的皮 肤表面大约含有1-10万个细菌。所以，人的规范洗手、更衣、戴口罩、眼罩、胡须罩、操作、手部定时消毒等措施必须做到。有统计，操作人员各部位的表面微生物污染比率约占鉴定样品的50%，因此，保证药品质量的关键因素之一就是做好人员卫生管理、规范更衣、无菌意识培养、无菌操作。
微生物的繁殖也是快的惊人，如细菌是以二分裂法进行繁殖，从一开始的1变2、2变4、4变8。。。，如每分钟分裂一次，则10分钟细菌就可繁殖到1024个，所以，洁净区内不能给微生物创造易滋生的条件。98版GMP要规定洁净区是温度18-26℃、湿度45-65%，这样的条件可以尽可能避免细菌的快速生长，因绝大多数细菌为37℃，接近自然宿主的体温。特别是洁净区内要尽可能干燥，如有水则微生物滋生迅速，是因为空气中的如湿度高，所有表面都包有一 层含水的薄膜，这层薄膜上的水分和养料为微生物的滋生提供了成长繁殖的条件。所以，清洗过的容器也要用压缩空气或氮气吹扫干燥，也是这个目的。但洁净区如污染霉菌（又分为毛霉、根霉、曲霉、青霉等，一般为需氧菌），则情况会更糟糕，因为绝大多数真菌生长条件为温度22～30℃和较高的湿度，在温度18-26℃、湿度45-65%下霉菌会疯狂生长，而霉菌又是以菌丝断裂或孢子进行繁殖，飞扬的菌丝和孢子是很难控制和杀灭的。
微生物的不均匀性也是样品或环境检验的一大特点。样品或环境中的微生物有时会检出，但复测时又没有，或是重新取样还是检不到，重现性很差。原因可能有：一是操作失误导致污染，二是样品或环境中微生物确实是不均匀分布的，只在那一次取样中有，三是有些不易检出的微生物，有可能营养缺失或生长缓慢未到时间。如对无菌检测来说，只有一项或多项下列情况发生时，测试才可能被考虑为无效测试：1、无菌测试区域的微生物环境监控数据显示有错误发生；2、发现测试过程有错误；3、阴性对照发现微生物阳性；4、测试污染微生物鉴定后，能明确地将微生物归因于无菌测试使用的物料/或技术错误。如判无效测试才可重新进行无菌测试。因此，在微限或无菌检测的房间内安装监控探头是非常有必要的。
微生物里还有一块重要工作就是污染菌鉴定。
微生物具有复杂性和变异性的显著特点。生物学先锋琳恩·马古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果将一个特殊的质粒植入大肠杆菌，大肠杆菌便会突然间变成克雷伯氏杆菌”。微生物的变异是绝对的，而其保守性却是相对的。再加上检验方法的可变性，如培养基差异>10%，计数偏差≈20%，重复性≈7.5%，称量差异为 1%-5%，容量差异为7%，培养基温度、分散均一性、操作速度带来的操作差异等，这些方法差异必然带来判定结果上的差异。而微生物的变异性也导致了污染菌鉴定的复杂性。
当产品、物料、水、环境、模拟灌装等的微生物出现异常，要朔源就需要开展实验室调查和污染菌鉴定。当鉴定微生物到种、属，可分析该菌是否常见菌、是否有致病性，对特殊菌种得分析其污染来源，一般水中污染大多为G-杆菌，而空气中和人体污染大多为G+球菌，再做菌的耐热性，是否有消毒液可以杀灭，反馈到车间加强清洁消毒、人员卫生等，并对一些物料中的特殊菌也可加入模拟灌装中测试是否能过滤或最终灭菌可以去除或杀死，这样就形成调查的闭环。
污染菌鉴定需要通过日常的鉴定、积累、保存菌种，建立一个自已厂内的污染菌菌库，对于发生微生物异常时就可识别风险、防患风险。污染菌鉴定一般流程如下：一是污染菌形态观察，包括在固体琼脂培养基中的菌落形状、大小、颜色、湿润光滑度、与培养基的结合程度以及其他特殊现象，液体培养基主要观察液体浑浊状态；二是通过转接到固体琼脂平板以获取纯菌落。细菌再接种至TSA培养基，于30～35℃培养18～24小时观察生长状况；真菌接种至SDA培养基，于20～25℃培养48～72小时观察生长状况；厌氧菌接种于TSA培养基，于35±2℃厌氧培养箱内培养18～24小时观察生长状况；如无菌落生长或菌落过小，可适当延长其培养时间。三是初步试验，如革兰染色及镜检（如细菌要在显微镜下放大40-100倍才能观察到），芽孢染色，鞭毛染色及活菌运动性观察，放线菌染色及形态观察等。四是API试剂条鉴定，根据氧化酶试验、氧化还原酶试验、过氧化氢酶试验及半固体穿刺运动性试验后选择合适的API鉴定试剂条，将实验鉴定结果输入API-Web软件，获取鉴定结论。鉴定结果部分鉴定结果需要进行补充试验，则按要求进行补充试验后再次判读结果。一般情况下，判读鉴定值≥80%时，认为是有效的鉴定结果；鉴定值＜80%时认为该鉴定结果无效。
对于污染菌是常见的非致病菌，则安全性较高，如是厂内的污染菌菌库内没有的新菌，则要保存好原始菌株以避免变异，新增到污染菌菌库内，如自已技术力量无法鉴定的，也可委外到更专业的研究机构进行。常见的疾病菌主要有：大肠杆菌（一种兼性厌氧微生物，有氧和无氧均可成长）、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、伤寒沙门菌、结核杆菌、炭疽杆菌等。这些菌绝对不能在产品中出现，否则面临报废。
五、我的梦想 1、职业梦想：成为制药行业的专业人士，虽然现在都不兴“砖家”（不专业或是误导）。在制药行业的微生物检验，佩服的专业“大咖”有马仕洪、柴海毅、崔强等。本人和柴老师工作交集较大，他是西安杨森培养的微生物专家，后来出来专门做工业化的培养碟，专业化的微生物培训加量身订做的技术服务，企业也越做越大。柴老师热爱微生物专业的精神是我的学习榜样，自已虽是“微生物制药”出身，但遗憾没有机会去从事这样“很有意思”的职业。“环境微生物监控”、“消毒剂选择”、“培养碟生产及使用注意事项”、“污染菌鉴定”等都是很好的研究领域。柴老师在卖碟挣钱的同时，还能做着自已兴趣爱好的工作，潜心做做微生物专业，为制药行业做一些贡献，做为商人这也算是莫大的幸福。
2、未来梦想：退休后，开一个微生物体验馆。因为对微生物的“不舍得”，想想不工作时，可以开个微生物体验馆，让小孩子COSPLAY 来认识精彩的微生物世界，如用不同培养碟对自已手部进行微生物培养，可以让他们更直观了解自已手部微生物种类，更注意个人卫生。或是对身体手脚等不同部位的采样，了解微生物的奇妙世界，也可以采集一些漂亮的微生物固化成标本，做为个人的珍藏（有人乐意吗？）。可以让小孩子亲自配制培养基，进行接菌、传代、培养、革兰染色、生化试验等，体验微生物各种操作活动，在显微镜下观察，也是一种科学学习的DIY活动。在体验馆可以展出发现微生物及其发展应用的历史，陈列各种微生物标本，让这种看不见、摸不着、数量庞大的生物直观展示在人们眼前，了解更多的科学知识，让人们更好地和微生物共存共生、和谐相处。
3、强国梦想：2016年5月13日美国白宫科技政策办公室宣布启动“国家微生物组计划”，这是奥巴马政府继“脑计划、精准医学、癌症登月计划”之后推出的又一个重大国家科研计划。什么是微生物组？人体、植物、土壤、海洋与大气中生活着多种微生物群落，这些群落的总和被称为微生物组。微生物多样化和复杂性是大家共识的，任何特殊处理都会改变其组成部分。“国家微生物组计划”的启动标志着微生物组学的一个里程碑，微生物虽小，但它们的影响巨大。2015年11月英国《自然》杂志刊载一文章，倡议实施“国际微生物组计划”。中国幅员辽阔，物种丰富，微生物资源多种多样，是许多国外科学家采样研究的主要国家。中国在微生物基础研究还相对薄弱，在肠道微生物研究、疾病相关微生物、基因测序，和微生物与人体营养、健康、环境之间紧密联系的相关研究还任重道远。中国也应适时启动我国的微生物组计划，在该领域中获得优势地位，平等参与到国际合作中，并最大程度地让中国人民受益。我们做为从业的一分子，理应为中国的微生物跨学科研究、开发检测及分析微生物组工具、培养更多微生物从业人员做一些力所能及的实事。
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发表于 2016-7-10 22:12:36
置顶卡
变色卡
厉害
