小奕说药 | 浅谈培养基中微量元素在CHO细胞培养过程中的作用

奕安济世生物药

得益于较好的安全性、与人体相似的糖基化修饰、高效的表达能力，以及适应悬浮培养等原因，中国仓鼠卵巢细胞（CHO Cell, Chinese Hamster Ovary Cell）是目前生物药生产的主流细胞。而CHO细胞的高密度生长及目的蛋白的高产量离不开培养基的支持。CD（Chemically Defined）培养基需要除水之外一些基本的营养元素，包含了碳源，氮源，磷酸盐，氨基酸，脂肪酸，维生素，微量元素及无机盐等。其中微量元素可以通过对CHO细胞的胞内和胞外的作用，对CHO细胞的乳酸代谢，能量代谢，蛋白产量及蛋白质量等方面进行调整，因此是培养基中的重要组成部分。

微量元素的介绍

通常微量元素在培养基中的含量非常低，并且在许多案例中，其浓度甚至会低于仪器的检测范围。但是与其浓度相反，微量元素却是能在调节代谢通路，激活一些特定的酶与信号分子的过程中发挥重要的作用。

1.1 微量元素之铜元素

铜元素被认为在CHO细胞培养过程中能下调乳酸脱氢酶及其他线粒体氧化酶活性，在不受培养中溶解氧的浓度影响下从而导致组织中毒性缺氧。因此高浓度的铜元素可以使CHO细胞从产生乳酸的代谢转换成消耗乳酸的代谢，增强细胞的生长及蛋白产量。铜元素通过影响抗体的C末端的赖氨酸含量从而改变碱性峰含量；也可通过影响色氨酸的氧化从而影响抗体的酸性峰含量。由于铜离子在细胞的生长，代谢及产量方面占有重要的地位，因此在优化培养基的铜元素时，需要对细胞培养表现与产物质量全方位进行平衡考虑。

1.2 微量元素之铁元素

铁元素被广泛的认为是CD培养基中非常重要的一个组成成分，铁元素在亚铁血红素的氧运输，线粒体氧化信号通路等中扮演了重要的角色。然而游离的三价铁离子即使是微量也会引起细胞的氧化应激。因此在培养基中需要一些螯合剂来降低铁离子所产生的毒性以及促进细胞对铁元素吸收的能力。例如转铁蛋白就不失为一种非常有效的铁离子载体，能显著的影响细胞对铁的吸收能力，在含有血清的培养基中，转铁蛋白通常被视为血清蛋白的一部分，而在无血清培养基中，重组的转铁蛋白可用于提高铁元素的稳定性与细胞的吸收能力。作为转铁蛋白的平替，一些小分子螯合剂例如环庚三烯酚酮，柠檬酸盐及亚硒酸盐也被添加在培养基中。由于知识产权的限制，环庚三烯酚酮尚未在CHO细胞的培养中得到大量的应用。亚硒酸盐与铁和柠檬酸盐的最佳搭配使用表明，亚硒酸盐通过改善细胞对铁元素的摄取能力，可以促进CHO细胞在缺少铁离子载体的培养基中生长，并且可以提供与环庚三烯酚酮相当的效果，而如果单独添加柠檬酸盐却不添加亚硒酸盐则没有相同的效果。后续有研究表明，硫酸亚铁与柠檬酸钠的联合使用可增加细胞的蛋白产量。

1.3 微量元素之锌元素

锌元素是被认为在无血清培养基及CD培养基中对蛋白产量影响最大的几个微量元素之一。有文献表明，在一些化学成分明确的商业化培养基中添加锌元素，可以提高1.2倍的蛋白产量，同时锌元素的添加也可降低CHO细胞的凋亡。并且通过在CHO细胞培养过程中提高锌对锰的比例，则可降低重组蛋白的半乳糖基化修饰。若是在CD培养基中提高铜元素浓度的同时降低锌元素的浓度，此时可发现蛋白的C末端赖氨酸的含量发生变化，进而影响到碱性峰的变化。

1.4 微量元素之锰元素

锰是几种参与N链聚糖合成的糖基转移酶的辅助因子，包括负责将半乳糖单糖添加到各种糖型上的半乳糖转移酶，如IgG单克隆抗体侧链上的天冬酰胺297（Asn - 297）残基。在CHO细胞培养过程中加入不同浓度的锰元素会导致不同的糖型。例如在培养CHO-K1细胞系时若添加40 μM的锰元素，则会使分泌的IgG1抗体的糖型发生改变，在降低G0与G0F的同时，增加了G1F的比例。然而对于高甘露糖型的影响，则有不同的研究报导。Pacis等人在2011年发表的研究表明，在细胞培养第三天加入0.25 – 1.0 μM则可有效降低高甘露糖（M5）的比例。Surve和Gadgil在2015年的研究显示，若在细胞培养过程中，当葡萄糖缺乏或者浓度受限时，加入锰元素则可提升产品大约27%的高聚甘露糖的比例。Karst在2017年的研究结果显示，在灌流工艺中锰元素与半乳糖的联合添加可增加产物的复杂糖型比例。

小结

大部分的微量元素在培养基中的浓度低于5 μM，上文仅描述了几种主要的微量元素，还有其他微量元素也能对细胞的生长、蛋白的产量及质量有着极大的影响。例如锰，钼，硒和钒被认为是细胞培养过程中所必须的，因此会被添加在大部分的培养基中。锗、铷、锆、钴、镍、锡和铬可能是某些哺乳动物细胞所需要的或具有某些功能，因此也包含在某些培养基中。尽管在CHO细胞培养过程中微量元素非常重要，但是过高浓度的微量元素反而会对CHO细胞的培养带来不利。当培养基粉末，其他原材料，或者细胞培养容器被某些特定的微量元素所污染时，如果恰好这些微量元素的浓度在培养基中处于临界状态，那么由于杂质的存在或制造不当可能导致培养基性能变化从而对细胞产生毒性。

表1.一些微量元素的主要功能

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