微生物限度方法验证

louisa19

在做微生物的计数验证时，如果有某种菌回收率不达标的情况时，有用到稀释法或薄膜过滤法。我不理解，可以直接用稀释法，稀释了不应该就得用薄膜过滤法了吗？比如，1:10的不达标，1:100的回收率满足要求，我是可以直接按1:100这个稀释级检测吗？那检测时如果有污染，不也相应稀释了吗？万一正好稀释到检测不出来，不是造成检测结果假阴性。这个稀释度可以无限稀释吗？

查理dd

1:100的要加大过滤量，保持总的检测样品量要一致，

空气在流浪

能否继续稀释，是要看你的质量标准的。比如，标准为10cfu/g，那样品的最小接种量为0.1g，且只能长一个菌，这就限制了稀释程度。如果你要更大的稀释，那你就要相应的增加接种的样品溶液体积，使样品接种量不小于0.1g.可以用薄膜过滤法，也可以用培养基稀释法，就是把培养基的量加大。

八档丶电风扇

最大稀释倍数不能超过你的样品标准，比如你的样品标准为103，那么最大稀释倍数就是103。
方法验证时1:10的不达标，1:100的回收率满足要求，可以直接按1:100这个稀释级作为日常检验方法；
但是高稀释倍数会有一个问题。就是很容易超标（比如1:100长菌数3、标准是102，就超标了、但是样品试剂污染菌没那么多），
所以在只能用高稀释倍数的情况下，薄膜过滤法可以通过多过滤供试液，平皿法可以通过多制备平皿累计计数的方式来避免这种情况。

机智鼠

在微生物限度方法验证中，选择稀释法或薄膜过滤法取决于样品的性质和测试目的。当回收率不达标时，确实可以考虑使用更高的稀释比例来尝试提高回收率。然而，这并不意味着可以无限制地增加稀释倍数。

首先，根据《中国药典》（最新版本）及相关微生物检测指南，样品的稀释应基于实验设计和预实验结果来确定。如果1:10的稀释比未能达到理想的回收率，而1:100的比例能够满足要求，那么可以选择1:100进行正式试验。但是，这一决定应当基于充分的理由和数据支持。

其次，关于污染的问题，确实存在因过度稀释而导致目标微生物数量低于检测限的风险，从而可能出现假阴性结果。因此，在进行高倍稀释之前，需要评估这种风险，并可能需要通过重复实验或其他确认步骤来确保结果的准确性。

最后，虽然理论上可以通过不断稀释来降低微生物的数量直至无法检出，但实际上这种做法并不推荐，因为它不仅增加了操作复杂性和成本，还可能引入更多的不确定性因素。正确的做法是在保证灵敏度的前提下找到最合适的稀释比例，并通过适当的方法学验证来确保检测结果的可靠性。

总之，在选择是否采用更高稀释比例时，应综合考虑多方面因素，并遵循相关法规和技术文件的要求。同时，对于任何异常情况都应该仔细分析原因并采取相应措施以保证测试质量。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

louisa19

八档丶电风扇 发表于 2025-2-21 11:25
最大稀释倍数不能超过你的样品标准，比如你的样品标准为103，那么最大稀释倍数就是103。
方法验证时1:10的 ...

谢谢老师，如果是药典的一般标准，即需氧菌10的3次方，霉菌、酵母菌10的2次方，1:10的回收率不符合要求的话，想用平皿法（不分多个平皿），最好就是1:20的稀释度。用更高稀释度（比如1:50，1:100）最好还是薄膜过滤法。我现在做薄膜包衣的辅料方法验证，标准是需氧菌1000cfu/g，霉菌、酵母菌100cfu/g（不是3次方和2次方）。现在1:20（平皿法）的需氧菌计数方法枯草回收率27%，霉菌酵母白念回收率32%。我1:50的稀释度，是不是最好供试液10ml薄膜过滤法了。

xdm20230413

谢谢各位老师分享!学习了

louisa19

机智鼠 发表于 2025-2-21 12:17
在微生物限度方法验证中，选择稀释法或薄膜过滤法取决于样品的性质和测试目的。当回收率不达标时，确实可以 ...

所以，正常按药典最低标准的话，1:100的稀释度（甚至1:50）通常都是和薄膜过滤法联合使用了。就不用考虑那么多风险，被提缺陷了，是吗？

为了微生物

louisa19 发表于 2025-2-21 12:37
谢谢老师，如果是药典的一般标准，即需氧菌10的3次方，霉菌、酵母菌10的2次方，1:10的回收率不符合要求的 ...

现在1:20（平皿法）的需氧菌计数方法枯草回收率27%，霉菌酵母白念回收率32%。
按照你目前的回收率，平皿法完全可以OK，试试1：50和1：100，如果怕检测的容易超标，TAMC做1：100，TYMC做1：50，前提是回收率OK。
如果用薄膜过滤法，如你所说使用1：50，就要取50ml过滤了。

louisa19

为了微生物 发表于 2025-2-21 12:58
现在1:20（平皿法）的需氧菌计数方法枯草回收率27%，霉菌酵母白念回收率32%。
按照你目前的回收率，平皿 ...

嗯，谢谢老师，我再试试。主要是这个辅料溶解性不好，如果用薄膜过滤法，供试液量也不能太大。怕把滤膜堵了。

八档丶电风扇

louisa19 发表于 2025-2-21 12:37
谢谢老师，如果是药典的一般标准，即需氧菌10的3次方，霉菌、酵母菌10的2次方，1:10的回收率不符合要求的 ...

其实不一定扩大稀释倍数。你的标准比较小，应该优先考虑使用中和剂来中和抑菌性；
1:50的话，正常薄膜过滤法是过滤50ml供试液（每张滤膜1g样品），也可以少、最后换算成1g样品对应结果即可