清洁验证中的内毒素问题

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制药生产企业对于无菌制剂产品的内毒素检测是必检项目，而且必须要符合药典的相应要求，内毒素的限度要小于0.25EU/mL。在无菌制剂的生产过程中是要控制内毒素的，那么我们应该在清洁验证的什么时候去进行内毒素的测试呢？如何取样进行内毒素的检测？应该制定什么样的内毒素接受标准？这些问题是值得我们考虑的。

在清洁验证中添加内毒素测试相对不复杂，所以通常在测试方案中会对清洁剂、上一批药物的活性成分的残留物、内毒素进行检测。如果生产的API产品有内毒素的限度要求，那么需要将内毒素测试作为清洁验证方案的一部分。但是如果API是通过生物反应，如细菌发酵得来，因为后续会有去除内毒素的操作工序，所以这种这种生产工序的前期阶段，清洁验证时可以不做内毒素检测的。

内毒素应如何取样？最常见的方法是收集淋洗水作为样品。众所周知，内毒素可以粘附在表面上并且难以从表面去除。而且相关的指南，如PDA TR29 中也有提到“对于微生物负荷或内毒素的取样回收率是不要求的” ，所有目前也没有太多的证据表明到底是漂洗水取样还是棉签擦拭取样更好，所以大多数企业采用取样操作相对简单的漂洗水作为内毒素的测试取样。

在清洁验证中，通常在最终的漂洗水测试中会检测内毒素的含量，一般限度会制定为WFI（注射用水）的限度，即0.25EU/mL。但是有一些公司可能会选择该限度的一半，即0.125EU/mL。最差条件下，这个设定值会与下一个产品的潜在污染相同，所以如果漂洗水样品中测量0.125EU/mL的限度，意味着潜在的最大残留量为0.125EU/mL将会带入下一个产品。

对于细胞培养后的罐体进行清洗，最终的漂洗水样品测试内毒素的值，通常情况下能符合WFI的限值；但对于大肠杆菌的发酵，发酵后的罐体进行清洗，一般不能满足内毒素限度符合WFI的要求。通常的做法有2种，一种是不会为这个步骤设定内毒素的限值；另外一种方式是将内毒素的限值调高，如设定限制为5~25EU/mL，能够达到这样的水平，证明清洁工艺是可控的，而且在后续的处理步骤中，也需要证明可以将内毒是水平降低到规定的限度。

关于内毒素的检测，各国药典中都有十分详细的规定，目前重组C因子法是一种快速的检测方法，已经被各国药典收录，要了解详细内容，可参考上一篇文章《内毒素检测趋势-重组C因子法》。

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