小奕说药 | 处方原理在稳定性问题上的应用——原液和蛋白药物成品的开发、生产和储存

奕安济世生物药

蛋白药物的处方和稳定性领域已经变得相当广泛，但大部分的焦点都集中在最终药品的稳定性上。实际上，蛋白质在从培养开始的生产过程中经受了压力和降解。因此Samadhi Vitharana等人综述了如何应用处方原理解决蛋白类生物制品在开发、生产和储存过程中的稳定性问题。

自从分子生物学方法用于生产重组蛋白以来，蛋白质在生产和工艺方面取得了许多进展。然而，与生物药生产有关的许多操作单元均可能导致蛋白质不稳定性。作者通过对上下游工艺过程和初级容器封闭系统中蛋白质的不稳定性进行评估，并结合制剂处方原理来减少蛋白质类药物在工艺和生产过程中可能发生的损害。

一、上游工艺中的不稳定性

对于上游工艺的细胞培养或发酵过程，蛋白质的主要不稳定性包括聚集、水解和化学修饰等。研究发现，蛋白质的固有倾向和性质、细胞培养过程中活细胞的密度以及单抗重链和轻链部分的过表达均影响着蛋白聚集的程度。一般来说，通过调节温度和持续时间等工艺参数是减少聚集的有效策略，特别是对于单克隆抗体和Fc融合蛋白。此外，在细胞发酵过程中，保护性添加剂对优化细胞培养基的价值也日益被人们所认识，具体如表1所示。

表1. 上游工艺过程中蛋白质的不稳定性和制剂处方策略

二、下游工艺中的不稳定性

2.1

蛋白质纯化

对于单克隆抗体和Fc融合蛋白最常见的纯化步骤是使用Protein A的亲和层析方法来捕获分子的Fc部分。在Protein A亲和色谱法中，Fc区被色谱柱捕获，从而允许所有非抗体蛋白流过，并在随后的低pH洗脱步骤中释放捕获的候选分子。研究发现与仅暴露于低pH条件下的样品相比，通过Protein A色谱纯化可加速蛋白聚集速率，故使用Protein A色谱柱低pH洗脱在纯化过程中存在蛋白质降解的风险。对于这一风险除了改良传统纯化方案，还可以实施一些配方策略以提高Protein A纯化过程中的蛋白质稳定性。例如，在pH值为3时磷酸盐缓冲液的加入对蛋白具有一定的保护作用；甘露醇可以在柠檬酸缓冲液(pH 3.5)中提高Protein A柱洗脱单抗的效率，改善了蛋白质的构象稳定性；在流动相中使用精氨酸盐可以在酸性较低的条件下使蛋白质从Protein A色谱柱洗脱。

2.2

病毒灭活/清除过程中的

蛋白质不稳定性

从细胞培养基开始，病毒载量是整个生物制剂生产过程中一个重要的安全问题，对于治疗性蛋白质最常用的灭活病毒的方法是低pH处理法。如上文所述，低pH洗脱不仅对Protein A柱纯化有影响，而且对随后的低pH病毒灭活步骤也有影响。Protein A纯化步骤本身也可以减少病毒载量，但在许多情况下并不有效。有研究报道，精氨酸可以提高灭活病毒的效率且这种影响与低pH条件灭活病毒具有协同作用；2 M硫酸铵（pH3）和含有表面活性剂LDAO的溶液也是有效的，且可以与Protein A 纯化结合使用。此外，甘露醇、蔗糖、4%山梨醇和海藻糖等赋形剂在低pH值灭活病毒期间也可稳定蛋白质。

2.3

过滤/无菌处理

在治疗性蛋白质的工艺流程中使用了许多不同的过滤步骤。这些操作包括纳滤去除病毒，超滤/洗滤(UF/DF)进行缓冲交换和浓缩，无菌过滤消除细菌污染。下表2中总结了这些各种过滤步骤引起的蛋白质降解，以及蛋白质降解物对过滤过程的影响。

表2. 过滤步骤中常见问题和制剂配方策略

三、与初级容器密闭系统接触引起的蛋白质不稳定性

对于生物制品常见的包装容器包括西林瓶、预充式注射器等。这些材料与蛋白质的相互作用均可能导致蛋白质的吸附或降解，具体如表3所示。此外，在治疗性蛋白药物静脉输注给药时，一般先用适当的稀释剂将药物稀释到静脉输液袋中。在这个过程中，药物可能会因各种原因导致不稳定性而形成颗粒，颗粒形成的程度与蛋白质的性质、稀释剂的种类(生理盐水或葡萄糖)和静脉输液袋的材质等密切相关。研究发现，邻苯二甲酸二异辛酯(DEPH)会带来安全性问题；与聚氯乙烯袋相比，当蛋白质被稀释到聚烯烃袋时似乎更稳定。但因为不同产品的特异性，形成聚集的原因也各不相同，这也表明进行临床相容研究试验以确认输注期间的兼容性和产品质量完整性是必不可少的。

表3. 生物制剂容器常见问题和解决策略

结语

治疗性蛋白质的不稳定性贯彻上下游工艺以及初级容器封闭系统。因此，需要深入了解原液和成品在生产过程中会经历的各种压力以及其降解、聚集机制，进而通过合理的处方筛选和浓度优化等策略来有效防止蛋白降解聚集等不稳定性，进而提高产品的质量和安全性。

参考文献

Vitharana S, Stillahn J M, Katayama D S, et al. Application of formulation principles to stability issues encountered during processing, manufacturing, and storage of drug substance and drug product protein therapeutics[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2023.

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