中篇：【耀文解读】新一代mRNA编码PD-1单抗有效抑制肿瘤生长

耀海微生物cdmo

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]二、编码单抗的mRNA的设计与优化

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]研究人员设计了编码帕博利珠单抗的重链mRNA和轻链mRNA，分别由5'帽结构（5' Cap1）、5'UTR、信号肽（SP）、CDS序列及Poly A尾巴组成。其中5'UTR和3'UTR分别来源于巨细胞病毒IE1和人生长激素基因的部分序列，PoyA尾巴长度为115nt。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在抗体信号肽序列的选择上，研究人员有3种候选序列，分别来自：人免疫球蛋白κ轻链（hIgLC）、白细胞介素10（IL-10）、人 IgG1 重链 (hIgHC)。将编码3种不同信号肽序列的单抗重链/轻链 mRNA进行配对，转染AML-12细胞，ELISA检测细胞上清液中帕博利珠单抗的表达水平。结果发现，携带hIgLC信号肽的mRNA能够表达出更高水平的单抗。在小鼠体内，单次注射携带三种不同信号肽的mRNA-LNP（0.5 mg/kg ），含hIgLC信号肽的mRNA产生的血清抗体水平也更高。因此，无论是从细胞水平，还是体内表达来看，选择人免疫球蛋白κ轻链（hIgLC）作为信号肽显然有利于增强mRNA的翻译表达。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]最后，在AML-12细胞水平和小鼠体内，探索了不同摩尔比的重链和轻链 (HC/LC) mRNA对抗体表达的影响。结果发现，当HC-mRNA与LC-mRNA比例为0.6:1时，mRNA翻译表达单抗的水平在细胞和小鼠体内可实现最大化。

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图2：编码单抗的mRNA的设计与优化三、编码单抗的mRNA的验证试验3.1 小鼠体内验证mRNA的翻译表达

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]向小鼠体内静脉注射0.2、0.6和2 mg/kg剂量的mRNA-LNP，可以明显观察到给药后血清中帕博利珠单抗水平呈现剂量效应。在直接注射重组型帕博利珠单抗（5mg/kg）后 0.25小时，血清帕博利珠单抗达到峰值，随后便急剧下降。相反，mRNA-LNP（2.0mg/kg）给药后48h，血清帕博利珠单抗达到峰值，并且在单次注射后的 35 天内保持在 20 μg/mL 以上。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]此外，向免疫缺陷小鼠每周一次静脉注射编码单抗的mRNA-LNP（2.0 mg/kg），每次注射后都可以观察到几乎一致的单抗血清浓度-时间曲线，表明在小鼠体内持续注射 mRNA 能够稳定、持续地表达抗体。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3：mRNA体内翻译产生单抗

3.2 mRNA翻译形成的单抗功能验证

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]研究人员比较了CHO 细胞来源的重组型帕博利珠单抗和mRNA技术体内翻译形成的帕博利珠单抗的功能差异性，主要涉及亲和力和结合特异性之间的差异，阻断PD-1 与PD-L1/L2结合能力的差异以及增强T细胞功能的差异。两种不同来源的单抗与人抗原(hPD-1)结合亲和力相似（KD 分别为 0.25 nM 和 0.61 nM），对稳定表达hPD-1 的CHO细胞的亲和力也相似（相似的EC50）。研究者还发现两种来源的单抗均能有效抑制 hPD-1 和 PD-L1/L2 之间的结合，重组型帕博利珠单抗的 IC 50 极低，为 0.36/0.67 μg/mL，帕博利珠单抗-mRNA 为 0.41/0.89 μg/mL。通过上述研究，采用mRNA技术体内翻译形成的帕博利珠单抗与CHO 细胞表达的重组型帕博利珠单抗具有相似的结合和阻断活性。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]利用混合淋巴细胞反应 (MLR) 评估两种来源的帕博利珠单抗的功能活性。用同种异体 CD4+T 细胞和DC细胞及两种来源的帕博利珠单抗混合，发现mRNA翻译生成的帕博利珠单抗和CHO细胞来源的重组型帕博利珠单抗均以浓度依赖性方式显着增加 T 细胞分泌的IFN-γ和IL-2。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]活化T细胞核因子(nuclear factor of activated Tcell,NFAT)是具有多向调节功能的转录因子,如调节T细胞的活化、分化及自身耐受性等。在荧光素酶报告系统中，两种来源的帕博利珠单抗均可有效激活NFAT 启动子。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图4：mRNA翻译形成的单抗功能验证

永恩

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