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本帖最后由 姣妹崽 于 2021-12-12 17:58 编辑
慢病毒（Lentivirus）载体是一种单链RNA病毒，是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，能够感染分裂和非分裂细胞。由于其可以将外源片段随机插入细胞基因组，因此可以在体内较长期表达目的基因，且免疫原性低、安全性高，是重要的基因操作工具。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀性”病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。 一、慢病毒（HIV-1）的基因组 HIV病毒基因组由两条正义链的RNA组成，约9kb的序列编码了9个蛋白，分别是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三个最大的阅读框编码了三个最主要的结构蛋白：gag、pol和env。 gag基因编码了HIV的核心蛋白，包含有基质蛋白MA、衣壳蛋白CA（P24）、核衣壳蛋白NC以及p6；pol基因编码了HIV复制所需的一系列酶，分别是蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）、整合酶（IN）。env基因编码病毒表面糖蛋白gp160，gp160剪切成为表面蛋白gp120（SU）和跨膜蛋白gp41（TM），这两个蛋白共同构成了HIV病毒的外层膜蛋白。 除了这几个主要基因，HIV病毒基因组还编码调节蛋白tat和rev。Tat蛋白能够激活病毒的转录，而rev蛋白则控制病毒转录本的剪接和出核。另外还有四个基因编码病毒辅助蛋白vif、vpr、vpu和nef。HIV基因组两侧各有1个LTRs（长末端重复序列），该序列对于慢病毒的转录，逆转和整合进入宿主细胞的基因组是必须的。病毒基因组的二聚化及包装信号ψ位于5‘LTR和gag基因之间。 图1. HIV-1病毒基因组 二、 HIV-1的感染过程HIV表面蛋白SU和其受体CD4及共受体CXCR4或者CXCR5结合，开启整个感染过程。 当完成受体识别之后，TM将改变构像，促进HIV的包膜与细胞膜融合，最终导致病毒核心粒子进入细胞内。进入细胞后，衣壳蛋白解体，释放出RT、IN等酶到细胞质。正义链的RNA被RT酶转化为双链DNA。随后该前体病毒DNA被转运进入细胞核，并被整合进入细胞基因组。 三、HIV的成熟过程病毒基因组整合进入细胞基因组后，在LTR的作用下起始病毒基因组的转录，并完成5’加帽和3’加尾过程。5’端的LTR具有一定的启动子活性，能够利用宿主细胞的RNA pol II进行转录。在缺乏病毒转录激活因子Tat的情况下，5’LTR的转录活性非常微弱。此时病毒转录产物进行多重剪接形成短转录本。这些短转录本编码非结构蛋白tat和rev。 tat蛋白与病毒的LTR结合后将会促进病毒所有基因转录本的表达，而rev蛋白通过结合转录本上的RRE（Rev-responsive element）来增强病毒的mRNA的出核转运，并促进单剪接mRNA和无剪接mRNA的成熟。单剪接转录本将编码env、vif、vpr、vpu，而无剪接mRNA被用于翻译gag、pol基因，并可以被用于作为子代病毒的基因组RNA（图2）。 图2 四、HIV-1病毒改造为慢病毒载体目前常用的慢病毒包装系统主要是第二代慢病毒包装系统和第三代慢病毒包装系统。在这部分我们将详细介绍第二代和第三代慢病毒包装系统如何通过改造以提高其生物安全性和感染效率。 1. 早期的HIV-1载体 最早期的慢病毒载体是可以复制的，只是携带了目的基因。不过该载体主要是用于进行anti-HIV的研究。随后，为了使该载体更为安全，病毒的元件被分离进入了两个质粒：（1）一个质粒包含HIV所有的除去env基因的前病毒DNA；（2）一个质粒表达env。 这样做的好处是，由于不带有env蛋白，这种病毒仅能进行一次感染，而无法进一步增殖。之后，该系统被进一步优化，除去病毒包装，逆转录与整合相关的顺势调控元件得以保留（RRE、ψ、LTRs），其它所有病毒蛋白均通过额外的质粒进行表达，一般采用CMV启动子进行启动。 2. 利用VSVG包膜蛋白增加慢病毒载体的宿主范围 由于HIV-1病毒的env蛋白只能识别CD4受体，早期的HIV载体所能感染的宿主范围非常狭窄。VSV-G蛋白来源于水疱疹病毒，最开始被利用于改造MLV。 通过用VSV-G蛋白取代MLV的env蛋白将获得两个明显的优势：（1）VSV-G蛋白比逆转录病毒或者慢病毒的env蛋白更加稳定，因此通过VSV-G蛋白“假型化”的病毒可以进行超离浓缩，从而获得更高的滴度。（2）VSV-G的受体是在细胞膜上广泛表达的磷脂酰丝氨酸，因此相较于env蛋白，VSV-G“假型化”病毒宿主范围变得更加广阔。目前，绝大部分慢病毒载体均采用VSV-G作为包膜蛋白。 3. 第一代慢病毒载体 慢病毒载体来源于病原体HIV-1，如何增加该载体的生物安全性一直贯穿于整个载体的改造历史。当采用复制缺陷的慢病毒递送基因时，一个重要的问题是如何避免具有复制能力的慢病毒产生。HIV-1是风险等级3的慢病毒（risk group 3），其研究必须在BSL3等级或者BSL2+的实验室进行。 为了减少在慢病毒载体过程中出现具有复制能力病毒的可能性，许多研究者做了大量的改进以降低这种风险。第一代无复制能力的慢病毒载体通过三质粒进行包装：（1） 一个包装元件质粒，表达gag/pol以及各种辅助蛋白；（2） 一个包膜蛋白质粒，表达VSV-G；（3）穿梭质粒携带目的基因。需要注意的是，包装元件质粒与包膜蛋白质粒均不含有包装信号ψ及LTRs，因此可以避免他们被包装进入慢病毒病毒载体颗粒中，降低了产生具有复制能力慢病毒的可能性。穿梭质粒上带有必要的顺式调控元件（RRE，ψ，LTRs）。同时，由于穿梭质粒上不表达tat基因，5‘LTR在没有tat蛋白的作用下转录能力非常弱。因此导入的外源基因一般需要通过一个额外的启动子进行表达。 通过三质粒包装系统，极大地降低了产生具有复制能力慢病毒的可能性。这意味着至少需要两次完整的重组事件才能产生一个具有复制能力的慢病毒。而VSV-G蛋白的使用也降低了这种重组的可能性。 4. 第二代慢病毒载体 研究发现，HIV-1的Vif、 Vpu、 Vpr 和Nef四个辅助蛋白，在缺失后不会影响病毒的复制能力。但是原代细胞和体内实验均证明这些蛋白对于病毒的致病性是必需的。例如淋巴细胞对于vif缺失的HIV-1病毒具有抵抗性，这是因为vif可以失活宿主细胞中的一个抗病毒因子APOBEC3G。类似的，vpu会失活细胞内的另外一个抗病毒因子Tetherin。而nef可以降解宿主蛋白比如MHV class Ⅰ和CD4，这将增加病毒的产生，加速免疫系统的崩塌。因此，第二代慢病毒载体包装系统删除了Vif、 Vpu、 Vpr 和Nef四个基因。加上用VSV-G取代HIV-1的env，第二代慢病毒载体只包含了HIV-1 的9个基因中的4个：gag、pol、tat、rev。 5. 第三代慢病毒载体 穿梭质粒两端被LTR包围，LTR含有3个区域：U3，R，U5。5‘LTR的U3具有增强子和启动子的作用，含有多个宿主细胞转录因子结合位点（Sp1、NF-κB等）。3’LTR的R区域充当mRNA加尾信号。而5’LTR的U3和3’LTR的U5不存在于病毒RNA中。LTR元件的复制在逆转录过程完成，此时3’LTR的U3将被复制然后转接到5’LTR上。自失活载体（SIN）删除了5’LTR的U3，并删除了3’LTR的U3的TATA 盒及Sp1，NF-κB结合位点，使其丧失了启动子活性（图3）。 图 3 由于第三代慢病毒载体删除5’LTR的U3区域，导致该穿梭质粒无法独立起始病毒的基因组RNA的转录，因此在5’LTR添加了CMV启动子以起始病毒基因组RNA的转录。同时由于不需要激活病毒5’LTR的启动子活性，tat基因也被从包装系统中删除。第三代慢病毒包装系统只包含了HIV-1的9个基因中的3个：pol、gag、rev。这进一步增加了该慢病毒载体的安全性。并且，即使发生重组导致pol、gag和rev被完整地整合到穿梭质粒中，由于LTR丧失了活性，该病毒也难以进行扩增，同时Vif、 Vpu、 Vpr 和Nef的删除也将该病毒的致病性降到最低。 吉凯基因目前采用的主要包装系统结合了第二代和第三代慢病毒载体包装系统，删除辅助蛋白Vif、 Vpu、Vpr 和Nef。并引入自失活载体（SIN），极大提高包装病毒的安全性的同时，也保证了病毒的高滴度。 慢病毒载体的安全性通过这一系列的改进，慢病毒载体的安全性得到了极大的提升。因此在临床研究中也有非常大的应用，比如很多Cart研究就采用慢病毒载体，多项研究成果已经进入临床实验阶段。然而，实验安全从来都是实验过程中首先要被关注的对象，不能也不应该被忽视。 考虑到慢病毒载体潜在的重组风险，具有整合进入哺乳动物细胞基因组的特性，以及携带外源基因可能致癌，我们建议慢病毒操作应在符合BSL2的实验条件下进行。同时，虽然大量的研究也表明在用慢病毒感染后没有观察到原癌基因的激活，但同时有文章报道在造血干细胞中通过慢病毒载体治疗地中海贫血症有检测到部分克隆的比例明显增加，这暗示随机插入导致的基因突变的风险仍然存在。我在这里把各类病毒载体比喻成普罗米修斯从神山偷给人类的火种。火是工具，是人类文明的源头，但它也是灾祸，是毁灭的起始。我们对任何事物的了解都是从浅薄到深入，但是深入了解并不是我们放松警惕，抛弃敬畏的理由。《三体》里有一句非常有哲理的话：弱小和无知从来不是生存的障碍，傲慢才是。同样，对于慢病毒载体，对其越多地了解，越多的改造的确有助于我们更加安全地使用，但是正确规范的操作可能才是对安全最基本以及最重要的保障。 建议大家使用慢病毒进行实验时请严格参照以下标准操作： A. 病毒操作时请穿实验服、戴手套、口罩和帽子; B. 病毒操作时建议使用生物安全柜！操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时生物安全柜有病毒污染，请立即用70%的酒精或0.06%次NaClO3溶液擦拭干净； C. 废弃物专门处理：6%次NaClO3溶液浸泡30min，或密封后高压灭菌后，丢入生物废物收集袋； D. 如不小心接触到皮肤请立即用大量肥皂水冲洗；实验结束后，用肥皂和水清洗双手。
原文来源：搜狐，吉凯基因 | 
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