消毒VS灭菌

luckylala

这个是2018年写的文章，大家没事可以吐吐槽

消毒和灭菌是微生物实验技术中最基本的操作技术，因此从事药品生产、检验的人员均应了解消毒和灭菌的基本概念、两者的关系，各自的应用方法及其意义，操作时应严格执行相关的操作规程，一方面确保生产与检验工作的效果，另一方面也是对自身安全的保护。

一、消毒和灭菌的概念

1、消毒：指对病原微生物的繁殖体的致死作用，但不能杀死芽孢等全部微生物，因此消毒是不彻底的，不能代替灭菌。凡用于消毒的化学药品称为消毒剂，因此人们也常称消毒剂为化学消毒剂。

2、灭菌：杀灭物体中所有活的微生物（含芽孢）的作用，灭菌是采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。通常用物理方法来达到灭菌的目的。

二、消毒和灭菌的关系

1、 共性：杀灭微生物以控制其污染和防止传播。

2、 区别：

分类	消毒	灭菌
微生物杀灭程度	微生物杀灭不完全，只能杀灭一部分病原微生物，但对于某些高效消毒剂在适宜的条件下也可达到灭菌效果	完全杀灭微生物，灭菌后的物品不应含任何活的微生物
方法	较单一，借助化学物质	方法多样，物理方法
效果评价	消毒剂消毒效力评估	灭菌工艺确认（含生物指示剂）、无菌检查法

三、消毒和灭菌的应用

1、消毒

1）消毒剂分类

依杀灭微生物能力进行分类，有以下三种：

分类	杀灭范围	举例
高效消毒剂	可杀灭所有种类微生物，包括细菌繁殖体、细菌芽孢、真菌、结核杆菌、亲水病毒、亲脂病毒	戊二醛、二氧化氯、过氧乙酸、环氧乙烷等
中效消毒剂	可杀灭细菌繁殖体（包括结核杆菌），大多数种类的病毒与真菌（不包括细菌芽孢）	醇类、酚类、含碘消毒剂
低效消毒剂	可杀灭大多数细菌繁殖体与一些种类的病毒和真菌（不包括结核杆菌、细菌芽孢和亲水病毒）	季铵盐类，双胍类

2）消毒剂的选择

消毒剂的种类很多，性质不一，因此应根据实际需求选择既安全又有效的消毒剂。在选择时至少应考虑以下几点：

序号	内容	原因
1	生物负载及种类	所需消毒区域原生物负荷及微生物种类，如是否存在芽孢、霉菌等
2	目标效果	需要明确控制微生物的程度，维持现有微生物水平还是抑制一段时间内的生长还是显著减少微生物的数量甚至杀灭
3	浓度/使用方法/接触时间	针对不同消毒剂应选择能达到目标效果的适宜浓度，其使用方法及接触时间会影响消毒的最终效果
4	接触物品材质	消毒剂接触的材质可能会与其发生反应，因此要考虑材质兼容性，且反复使用对如设备表面或其接触材质会有腐蚀性，应考虑接触材质的耐受程度
5	消毒剂残留	多数消毒剂会在使用后在消毒材质表面留下残留，因此应明确应用范围来选择是否可接受消毒剂残留，另如有残留如何去除，另若轮换使用消毒剂，则还应考虑不同种类消毒剂的化学兼容性
6	保质期	该项应考虑消毒剂的光敏性，还有使用浓缩液及稀释液的不同效期规定，稀释液的效期一般由验证所得，其稳定性与浓缩液不同，应考虑满足使用需求
7	安全性	所有消毒剂均应有其MSDS，该项应慎重评估应用时可能对人员的影响及可采取的防护措施；另应考虑选择在该药企中被允许使用的化学剂种类
8	供应商	应考虑选择有资质及有能力支持消毒剂效力验证实际能在使用方落地的品牌供应商

3）消毒剂的使用

A、影响消毒效果的因素

影响消毒剂效能的因素比较复杂，一般都因消毒剂的种类而异，因此各种消毒剂使用时应注意以下因素

a）微生物种类及数量

消毒剂的有效浓度及作用时间因微生物的种类及数量的不同而有差异，不同类型的病原微生物对消毒剂的抗力不同。对于细菌繁殖体来说，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌对消毒剂的耐受性强，尤其是铜绿假单胞菌的耐受性较强；芽孢的耐受力最强，在化学消毒剂中，戊二醛和过氧乙酸可杀灭芽孢，但其作用力不如热力灭菌方法；病毒对消毒因子的耐力也因其种类的不同而有相当大的差异，亲水病毒的耐力较亲脂病毒要强；真菌对大多数化学药物的耐受力较强，因此适用于细菌的消毒剂并不一定适用于真菌，但真菌一般耐热性较差。微生物污染数量多时，应加长消毒接触时间、加大消毒剂用量或提高消毒剂浓度。

b）温度

一般来说，消毒的速度随温度的提高而加快，其杀菌作用也相应增强。温度影响的原理是其可影响菌体表面和酶系统的活性，以及消毒剂的分子运动，使得消毒剂与菌细胞接触的机会增加，从而使消毒的时间缩短。但温度的变化对各种消毒剂的影响不同，如醇类和酚类一般受温度影响较小，但如甲醛、环氧乙烷等温度升高一倍时，其杀菌效果可增加十倍。

c）浓度

消毒剂的浓度应考虑的是其主要成分的浓度，根据不同类型的消毒剂性质，提高或降低浓度，均可显著影响消毒效果。一般降低消毒剂的浓度需延长相应的消毒时间，且消毒剂内的有效成分在其保存期内也会相应下降。

d）pH值

酸碱度常影响酸性或碱性消毒剂的电离度，改变其溶解度及分子结构，影响不同离子型消毒剂的作用，在碱性环境中，细菌表面负电荷增多，阳离子型消毒剂作用较强，在酸性环境中，细菌表面负电荷减少，阴离子型消毒剂的杀菌效果较好；另外pH的过高或过低对微生物的生长及表面物理化学状态均有影响。

e）有机物质

消毒环境中存在有机物，则其可在微生物表面形成保护层阻碍消毒剂与微生物的接触或延迟消毒剂的作用，可能导致微生物逐渐产生对药物的适应性，这些情况均会不同程度的降低消毒剂的消毒作用，如有机物可中和一部分消毒剂，有机物和消毒剂作用，形成溶解度比原来更低或杀菌作用比原来更弱的化合物。一般来说消毒剂中的重金属类及表面活化剂等受有机物的影响较大。

B、其他注意点

a）微生物对消毒剂的耐受性

一般来说，为了避免微生物对消毒剂的耐受性，很多企业的消毒剂是轮换使用的，现今在学术界对于消毒剂的轮换使用的必要性尚存争议，但FDA的监管引文中主导应进行消毒剂轮换，但消毒剂的轮换使用周期应以历史环境监测数据为基础制订。微生物对消毒剂的耐受性较抗生素要低一些，因为消毒剂比抗生素有更强的杀菌作用。另外使用高浓度的消毒剂来杀灭少量的微生物通常影响不大，因此应考虑选择合适的消毒剂来对抗不断增强的耐受性。同时建议定期进行试验证明或评估从环境菌监测中分离出的微生物（含已知及新的类型）对该环境使用消毒剂的敏感性。

b）规范及安全使用

在消毒剂的使用过程中，人员培训及是否规范及安全使用该消毒剂对其应用有很大影响。接触消毒剂的人员要求进行微生物、清洁灭菌操作、消毒剂的制备/使用/安全处理废弃稀释及浓缩消毒剂的培训。如正确配制消毒剂是关键，很多消毒效果不佳或失败的例子源于消毒剂的过度稀释，另外用于无菌操作流程的消毒剂必须用无菌水稀释，一般稀释用水推荐纯化水及更高级别的水，因为水的硬度会影响一些消毒剂的功效。另外在处理可能产生有毒刺激性气体、腐蚀性较强及浓度较大的消毒剂（如杀孢子剂）时，应配备适宜的安全防护装备，如安全眼镜、面罩、过滤气味的口罩、手套、防护服等。在消毒剂的使用同时应考虑清洁剂的配合使用，清洁是去除表面颗粒及微生物、去除残留并提高后续消毒效果，因此清洁是为后续的消毒做好准备，同时规避前后2种轮换消毒剂的互相作用。

2、灭菌

灭菌的手段及设备，分别称为灭菌法及灭菌器。灭菌法系指用适当的物理和化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去，从而使得物品残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。

1） 灭菌法的分类及选择

分类	举例
热力灭菌法	湿热灭菌、干热灭菌
辐射灭菌法	电离辐射（如60Co-γ射线），电磁波辐射（如紫外线）
气体灭菌法	环氧乙烷、臭氧、甲醛、过氧乙酸、气态过氧化氢
过滤除菌法	空气过滤、液体过滤
应根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法组合灭菌，若被灭菌物品允许，应尽可能选用最终灭菌法进行灭菌；若物品不适合采用最终灭菌法，则可选用过滤除菌法等方法进行。

2）常见灭菌方法的应用

A、湿热灭菌法

a）概念：将物品至于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽，过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。因其穿透力比干热强，所以为热力灭菌中最有效且应用最广泛的灭菌方法。

b）对象：药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞等遇高温及潮湿不发生变化和损坏的物品均可选择湿热灭菌方法进行灭菌。

c）方法：煮沸灭菌、巴氏消毒、流通蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌等。

d）使用：各方法的选择应考虑被灭菌物品的热稳定性、热穿透力及微生物的污染程度等因素。其中流通蒸汽灭菌仅可杀死细菌繁殖体，不能完全杀灭芽孢。药品生产企业基本使用高压蒸汽灭菌方法，其使用的灭菌程序及物品装载必须经过验证，证明所采用的灭菌工艺和监控措施在日常运行过程中能确保物品灭菌后的效果达到要求，应注意排出灭菌器内的冷空气及被灭菌物品的内部温度。

B、干热灭菌法

a）概念：将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌设备等中，利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法，主要原理是强热能使蛋白质凝固而导致细胞死亡。

b）对象：适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品，如玻璃器具、金属、纤维制品、固体试药、液状石蜡等。

c）方法：灼烧与火焰灭菌、干烤灭菌等。

d）使用：药品生产企业使用干烤灭菌对物品进行微生物的杀灭及热原的去除，干烤灭菌是利用热辐射及干热空气进行灭菌，因空气不是热的良导体，传热慢，同时穿透力不强，因此干热灭菌时间较长。采用干热过度杀灭的物品一般无需进行灭菌前污染微生物的测定。其使用的灭菌程序及物品装载必须经过验证，应注意装入干烤设备中的物品间应有间隙，利于热空气的流动，确保物品受热的均匀。

C、辐射灭菌法

a）概念：将物品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。

b）对象：医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品均可使用。

c）方法：60Co-γ射线辐射灭菌、紫外线、红外线、微波等。

d）使用：影响辐射灭菌的因素有微生物的种群及数量、氧气、温度、共存物等。常见的γ射线辐射灭菌所控制的参数主要是辐射剂量，即灭菌物品的吸收剂量，该剂量的制订应考虑灭菌物品的适应性及可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，事先应验证所使用的剂量不影响被灭菌物品的安全性、有效性和稳定性。灭菌时，应采用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控，以充分证实灭菌物品吸收的剂量在规定的限度内。另外对于辐射的安全性问题也需非常重视，一方面是辐射的直接作用，另一方面是经辐射物品的安全性问题，因此人员防护及经辐射物品的安全性评价试验十分必要。

D、气体灭菌法

a）概念：用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。

b）对象：适用于在气体中稳定的物品灭菌。

c）方法：常用的化学消毒剂有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛及臭氧等。

d）使用：采用该方法灭菌时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒性。一般气体灭菌多用于器械、塑料制品等灭菌，常用的环氧乙烷灭菌法即可用于这类不能采用高温灭菌的物品灭菌，但含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜。灭菌条件应进行验证。灭菌时的温度、湿度、灭菌气体浓度及灭菌时间是影响灭菌效果的重要因素，该些参数应在灭菌过程中严密监控。环氧乙烷灭菌时还应进行泄露测试，以确认灭菌腔体的密闭性。灭菌后应采用新鲜空气置换，同时应对灭菌物品中的残留物和反应产物进行监控，使其控制在可接受的浓度范围内。

E、过滤除菌法

a）概念：利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。

b）对象：用于气体、热不稳定的药品溶液或原料的除菌。

c）方法：除菌过滤器。

d）使用：过滤除菌的效果通常与滤膜的性能、孔径、密度及滤膜的厚度等因素有关。除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，微孔滤膜分为亲水性和疏水性两种。滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定。药品生产中采用的除菌滤膜孔径一般不超过0.22μm，用于最终除菌的过滤器应选择具有截留实验证明的除菌级过滤器。选择过滤器时应考虑其对滤液的吸附不得影响药品质量，不得有纤维脱落，另外应了解滤液过滤过程中的析出物性质、数量并评估其毒性影响。每次过滤除菌前后均应进行滤器的完整性测试，确认滤膜在过滤过程中的有效性和完整性。

四、消毒和灭菌的效果评价

这两个方法的效果评价非常复杂，因此本章节仅进行简述，描述基本的框架，具体的效果评价方法应严格按照法规要求并结合自己企业的消毒及灭菌要求进行。

1、消毒剂消毒效果确认

一个消毒剂是否具有杀菌作用及其杀灭微生物的效力即是消毒剂效力测定的内容，任何一个消毒剂的选择及其实际应用的浓度，均应以实际应用条件下效力测定结果作为依据。最常用的消毒剂效力测定方法为酚系数测定法及定量悬浮试验。

为确认在生产环境中使用的消毒剂的有效性应考虑以下几点：

1）试验菌确认

消毒剂分类	AOAC挑战菌	环境中分离的典型菌（推荐）
杀菌剂	大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌	藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、杰氏棒状杆菌、泡囊假单胞菌
杀真菌剂	白色念珠菌、黄青霉菌、黑曲霉	黄青霉菌、黑曲霉
杀孢子剂	枯草芽孢杆菌	球形芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌

2）中和剂效力及毒性确认

为准确评价消毒剂对微生物的杀菌作用，在消毒实验中要求选择适当的中和剂。中和剂的作用是不仅能及时中止消毒剂的杀菌作用，而且中和剂本身与消毒剂的反应产物应对微生物无抑制或杀菌作用，且对微生物的生长无影响。常用的中和剂如下表所示：

消毒剂	中和剂
乙醇	稀释液或吐温80
季铵类化合物	吐温80及卵磷脂
酚类化合物	稀释液或吐温80及卵磷脂

3）杀菌效率确认（以定量悬浮试验举例）

定量悬浮试验是评价消毒剂杀菌效果常用的一种定量试验方法，其原理为将定量的菌悬液加入消毒剂溶液中，作用一定时间，去除残留的消毒剂影响后，定量接种于监测琼脂平板上，经培养后计算其菌落数，与未经消毒剂作用的对照菌液平板计数相比较，计算出杀菌效果，

一般用下降几个对数值表示对消毒剂杀灭效果的评价。

4）接触时间确认

接触时间是指从消毒剂开始使用到移除消毒剂之间的时间。这个时间对消毒剂的效果很关键，该时间即为消毒剂的工作时间，一般推荐时间为10min。方法是用标准试验菌株和从环境中分离出的典型菌，使用选择好的消毒剂浓度在消毒表面作用一定的时间，计算试验菌减少量的对数值。

5）消毒剂稀释液有效期

消毒剂浓缩液的供应商均有其推荐的浓缩液及经稀释后消毒剂的有效期，但因贮存及使用地点、配制条件等不同，其有效期应进行确认。应按验证时进行的要求制备稀释液，应使用不同的消毒接触载体以确定减少的对数值，并选择多一些的时间点进行测试。

6）表面挑战试验

通过对不同材料上接种的微生物的恢复性进行确认，以确定不同材质的接触面对消毒效果的影响。因为洁净室和其他受控区域所使用的建筑材料不太相同，因此需要对消毒剂会接触的每一种材料分别进行评估并进行消毒剂的杀菌效力验证。

7）现场测试

现场测试顾名思义即在实验室进行效果测试确认使用浓度、作用时间、可接触的材质并确认其杀菌效率后，在消毒剂实际使用的现场进行消毒效果的测试。现场测试前应确定取样方法，一般为接触皿法和棉签法，所选择的方法是基于所要取样的表面尺寸及形状。平整表面及取样面大于等于接触面直径，一般选择接触皿法；非规则平面一般选择棉签法。在使用该取样方法前，应确认该取样方法的回收率，该方法应经过确认。使用已验证的消毒方法对现场各类材质表面在消毒前后进行取样测试。

2、灭菌效果确认

因在灭菌程序的验证中，虽然可通过灭菌过程的某些参数监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被杀灭程度，是评价一个灭菌程序有效性的最直观指标，因此本段仅进行各灭菌方法中生物指示剂确认的简介，不进行灭菌工艺中物理参数确认的阐述。

1）生物指示剂的概念

生物指示剂系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌孢子。细菌孢子应具备以下特征：菌种的耐受性应大于产品中污染微生物的耐受性；菌种无致病性；菌株生化特性及抗力应稳定且易保存；易培养、存活期长，休眠孢子含量可达90%以上。

2）生物指示剂的选择

可使用市售的标准生物指示剂，也可使用由日常生产污染菌监控中分离的耐受性最强的微生物制备的孢子。

3） 生物指示剂的使用

在使用前应确认孢子在实际灭菌条件下的D值，并测定孢子的纯度及数量。应根据不用的灭菌方法选择适宜载体的生物指示剂，如湿热灭菌中的固体灭菌常用滤纸片负载指标菌、液体灭菌常用液体，气体灭菌常用不锈钢材质等。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。生物指示剂在灭菌腔体及环境中的放置位置应考虑均分原则及在最难灭菌处放置，同时灭菌时应注意不遮盖指示剂的灭菌介质进入口，如Tyvek包装的指示剂的Tyvek面，湿热灭菌指示剂上的蒸汽流通口等。在灭菌取出后，应根据不同培养条件进行培养，并在规定时间确认结果。

4） 各灭菌法常用的生物指示剂

方法	常用生物指示剂
湿热灭菌法	嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus stearothermophilus）    生孢梭菌孢子（Spores of Clostridium sporogenes）
干热灭菌法	枯草芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus subtilis）
辐射灭菌法	短小芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus pumilus）
气体灭菌法	环氧乙烷：枯草芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus subtilis）    气态过氧化氢：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus stearothermophilus）
过滤除菌法	0.22μm滤膜孔径滤器：缺陷假单胞菌（Pseudomonas diminuta）    0.45μm滤膜孔径滤器：黏质沙雷菌（Serratia marcescens）

本文粗略的归纳了消毒和灭菌的一些浅显的概念并对消毒和灭菌的不同点及其应用进行了简单的阐述，文中引用了参考资料中的内容进行科普，对于实际在生产及实验室的消毒及灭菌方法的应用因遵循相关法规细则及供应商提供的技术资料进行，特此注明。

【参考资料】

1、《中华人民共和国药典》2015版四部，1421灭菌法

2、USP 38 <1072>Disinfectants and Antiseptics

3、《制药洁净室微生物控制》-化学工业出版社

4、《药品微生物学检验技术》-华龄出版社

wgx1979

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