纯化水长菌

山顶洞人

偶然中有必然，必然有时候看起来又像偶然，灭菌参数是最值得怀疑的地方！
楼主记得最后来本帖下个结论！

戴木木

我们北京三药的培养基，说明书上面说15分钟，但我们实际上灭22分钟，锅是100L的

cnosema

阴性对照都长菌，说明培养基或者培养皿有问题。同一个批次一起灭菌的培养皿，用于铺其它的平板，没有问题，说明培养皿没有问题。

锥形瓶里的培养基，你直接放培养箱培养一下，长东西吗？

黄知莲1204

我觉得你阴性都长了那肯定是培养基的问题，灭菌温度，还有我们做的时候会遇到灭菌前后颜色不一样。而且你重新换了培养基批号，你要做培养基系统适应性才能用啊，买了不能直接用吧。

桃花酒仙

ccmlhs 发表于 2016-6-22 12:30
一般15分钟容易长菌，30分钟试下！

别忽悠楼主，灭30分钟的培养基你做过适用性没？会影响回收率的

桃花酒仙

楼主最后一段话没看明白：“然后决定最后用这瓶培养基一次后开启新的培养基，结果突然又不长菌了。这样持续不长菌一个多月后，这个星期又开始长菌了。”
这个是指：
1.和这瓶长菌的R2A同一批配制的其他R2A再用一次？
2.这瓶干粉R2A再重新配制培养基、灭菌、检验？
3.这瓶长菌的R2A倒的碟子再用一次？

桃花酒仙

这都长得像菌液计数了。。内外都长、分布均匀
1.一般倒平皿时散落的几个CFU菌不会污染成这德行
2.环境污染我觉得可以不考虑在本案内
3.人员不能排除嫌疑，暂时无法时空穿越得出结论，建议以后增加日常接触碟采样，并进行菌种鉴别并积累数据建立各种检出菌的菌种数据库，以后出现异常时和检出的菌进行对比，积累是个过程，到几年就会发现是很有用的。
4.关于培养皿（等器具），灭菌条件我相信你们是真实做过验证的，不会存在问题，TSA等培养基的阴性也是没有长菌的，也降低了怀疑率，但也需要追溯R2A平板使用的平皿在罐内的堆叠位置、干热时罐子通气口是否打开等
5.关于培养基，我觉得是本案的重点，作为第一排查对象：培养基灭菌使用的灭菌柜
    5.1 灭菌柜验证时，是否做过热分布？灭菌柜的冷点在哪个区域？此批培养基可否追溯到灭菌时在灭菌柜内的放置位置？是否位于冷点及附近
    5.2 灭菌柜验证时，是否规定了固定的满载装载方式、并在本次灭菌时按验证的装载位置进行物品放置
    5.3 生物指示剂挑战时是置于液体培养基内还是器具内
    5.4 培养基瓶子是否存在破损、裂纹等导致污染
    5.5
6.同楼上某楼，配制、灭菌好后的R2A培养基，就那么放着，也会长菌吗（长菌挺明显的）
7.刚才说到TSA、SDA等的阴性都是没长菌的，那检品的碟子呢？有没有检出和此R2A中检出菌形态、镜检相同/相似的菌落
8.配制培养基的水是什么水，有没有进行质量控制，如过滤除菌等
9.此R2A内的检出菌，有没有革兰染色及芽孢染色
10.不好意思，思维有点跳跃，没有整理好语言。如果每次都是R2A长菌、其他TSA、SDA等都不长，挺奇怪的现象，希望调查出结果了再来这里分享一下，谢谢

夏慕慕

夜夜夜夜 发表于 2016-6-22 13:56
铺的时候没在酒精灯旁啊，手出工作台不喷消毒剂又继续操作了，很多吧。还有碟子和桶灭之前清洗不干净啊， ...

铺培养基的时候确实没在酒精灯旁，只放薄膜的时候是在酒精灯旁。手出工作台再放进工作台的时候，没有喷消毒剂，只用酒精棉擦手，因为实验室的喷洒消毒剂在缓冲间，这个会有影响吗？预培养确实会长菌！

夏慕慕

编号⑨⑤②⑦ 发表于 2016-6-22 14:35
没事的，我们一般20min，以前我做过的一个公司他们怕灭菌不彻底灭30min的

好的，谢谢老师。

夏慕慕

hulugourd 发表于 2016-6-22 16:11
楼主，你这明显是培养基本身长菌了啊！你没发现有些菌是长在培养基内部的吗？（你可以再确认一下）也就是说 ...

是的是的，培养基内部表面都长了菌的，但是关于液体就染菌了是指？因为配制成液体后也要在高压灭菌锅里灭菌的呀？刚做微生物很多还是不懂，能麻烦说的详细点吗？

夏慕慕

山顶洞人 发表于 2016-6-22 16:11
偶然中有必然，必然有时候看起来又像偶然，灭菌参数是最值得怀疑的地方！
楼主记得最后来本帖下个结论！

好的

夏慕慕

戴木木 发表于 2016-6-22 21:10
我们北京三药的培养基，说明书上面说15分钟，但我们实际上灭22分钟，锅是100L的

是的，我们用的也是北京三药的，但是锅是80L的

夏慕慕

cnosema 发表于 2016-6-22 22:07
阴性对照都长菌，说明培养基或者培养皿有问题。同一个批次一起灭菌的培养皿，用于铺其它的平板，没有问题， ...

这个还没想过诶，谢谢谢谢！这样的话就可以排查是不是培养皿的问题了！真是太感谢了！

夏慕慕

黄知莲1204 发表于 2016-6-22 22:40
我觉得你阴性都长了那肯定是培养基的问题，灭菌温度，还有我们做的时候会遇到灭菌前后颜色不一样。而且你重 ...

是不同批号使用时，才做培养基的适用性实验吧！我们实验室是同一批号，买的时候买了两瓶，另一瓶没开封

夜夜夜夜

夏慕慕 发表于 2016-6-23 08:48
铺培养基的时候确实没在酒精灯旁，只放薄膜的时候是在酒精灯旁。手出工作台再放进工作台的时候，没有喷消 ...

结净区要酒精棉干嘛。。。一个喷壶就OK了啊，消毒剂这玩意自己拿乙醇就能兑，不用这么省吧，预培养长菌你这百分百是碟子自己的问题，延长培养基灭菌时间，中间步骤勤消毒，还有一个问题，你铺完的碟子存放了多久？是否超出有效期？

hulugourd

夏慕慕 发表于 2016-6-23 08:52
是的是的，培养基内部表面都长了菌的，但是关于液体就染菌了是指？因为配制成液体后也要在高压灭菌锅里灭 ...

意思就是说，这种现象说明了有大的微生物负荷在培养基还是液态的时候就已经接触了，其他因素比如环境洁净度，人员的接触污染一般都无法造成这种现象。你可以查三个方向：
1.灭菌效果。去鉴别一下污染微生物的种类，你的灭菌锅已经做过确认。如果污染菌不是耐热性微生物，比如芽孢，灭菌这一关就不是原因。因为你的灭菌锅确认是按远超过通常的污染量来设计的，即过度杀灭，就算灭菌有些小的问题，也足以杀死大部分微生物，不会像你这样这么大量污染。
2.灭菌结束后转移到洁净区倒平皿前的过程是否可能被污染。比如，装R2A的瓶子是否完整，有没有可能有污染物经过你的塞子进入到瓶子中，尤其是液体如冷凝水！
3.空平皿。检查转移到洁净区的过程。检查有无灭菌后再污染的可能，依然需要关注冷凝水的问题。有没有存在上下颠倒的动作导致冷凝水流到皿的外面再回到皿内部的可能？

cnosema

夏慕慕 发表于 2016-6-23 08:52
是的是的，培养基内部表面都长了菌的，但是关于液体就染菌了是指？因为配制成液体后也要在高压灭菌锅里灭 ...

培养基长菌，说明培养基灭菌不够呀

cnosema

夏慕慕 发表于 2016-6-23 08:55
这个还没想过诶，谢谢谢谢！这样的话就可以排查是不是培养皿的问题了！真是太感谢了！

对，从你描述的情况看，不是培养皿的问题

黄知莲1204

夏慕慕 发表于 2016-6-23 08:59
是不同批号使用时，才做培养基的适用性实验吧！我们实验室是同一批号，买的时候买了两瓶，另一瓶没开封

额， 同一批号那就不知道啦，但个人觉得还是培养基的问题

ccmlhs

桃花酒仙 发表于 2016-6-22 22:47
别忽悠楼主，灭30分钟的培养基你做过适用性没？会影响回收率的

如果你说的是真的话，那就当我没说！我只是给出我的建议……看了你的回复，我也涨知识，谢谢！