纯化水长菌

夏慕慕

本人微生物新手一枚，现在做纯化水微生物检测时，遇到困难，恳请各位老师指点帮助。我们实验室做纯化水用的培养基买来的R2A培养基。，前面做的几个月都是好好的。从最近这几个月开始，R2A培养基开始长菌，就是每个皿都长，包括阴性，如图。
刚开始是觉得装培养基的器皿（广口锥形瓶）有问题，所以在打开牛皮纸，倒培养基之前用酒精棉把瓶口及塞子仔仔细细的擦了三遍，结果培养基还是长菌。
然后怀疑是培养皿的问题，但是每次灭菌都是按规定来，在165℃灭菌2小时。而且同天做的其他成品的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基的阴性都未长菌。
再来但是培养箱的环境有问题，于是换了一个培养箱，但是R2A培养基还是长菌。
所有的都折腾一遍后，最后觉得是那瓶培养基有问题，可能是受污染了，然后决定最后用这瓶培养基一次后开启新的培养基，结果突然又不长菌了。这样持续不长菌一个多月后，这个星期又开始长菌了。我真的是实在找不到原因了，恳请大家帮助我找一下原因分析分析，谢谢了！（以上实验都是同一个人完成的）

老猫王磊

假设这个检验结果是错误的，那么导致这种误差的原因有以下几点：1、检验环境有问题；2、检验用的物料有问题；3、检验方法有问题；4、检验人员问题。根据你描述的情况，我们大体可以排除1、检验环境问题；2、检验方法问题；不能完全排除的是检验物料的问题，这个物料中包括应用的设备，比如灭菌器的问题，没见你进行排查！最有可能发生的检验人员的问题没有排查；建议：
1、更换新的培养基，并严格按照要求做相关的灵敏度等验证！
2、确认灭菌器的工作状态！
3、换人对比操作！
4、环境彻底大清！

桃花酒仙

这都长得像菌液计数了。。内外都长、分布均匀
1.一般倒平皿时散落的几个CFU菌不会污染成这德行
2.环境污染我觉得可以不考虑在本案内
3.人员不能排除嫌疑，暂时无法时空穿越得出结论，建议以后增加日常接触碟采样，并进行菌种鉴别并积累数据建立各种检出菌的菌种数据库，以后出现异常时和检出的菌进行对比，积累是个过程，到几年就会发现是很有用的。
4.关于培养皿（等器具），灭菌条件我相信你们是真实做过验证的，不会存在问题，TSA等培养基的阴性也是没有长菌的，也降低了怀疑率，但也需要追溯R2A平板使用的平皿在罐内的堆叠位置、干热时罐子通气口是否打开等
5.关于培养基，我觉得是本案的重点，作为第一排查对象：培养基灭菌使用的灭菌柜
    5.1 灭菌柜验证时，是否做过热分布？灭菌柜的冷点在哪个区域？此批培养基可否追溯到灭菌时在灭菌柜内的放置位置？是否位于冷点及附近
    5.2 灭菌柜验证时，是否规定了固定的满载装载方式、并在本次灭菌时按验证的装载位置进行物品放置
    5.3 生物指示剂挑战时是置于液体培养基内还是器具内
    5.4 培养基瓶子是否存在破损、裂纹等导致污染
    5.5
6.同楼上某楼，配制、灭菌好后的R2A培养基，就那么放着，也会长菌吗（长菌挺明显的）
7.刚才说到TSA、SDA等的阴性都是没长菌的，那检品的碟子呢？有没有检出和此R2A中检出菌形态、镜检相同/相似的菌落
8.配制培养基的水是什么水，有没有进行质量控制，如过滤除菌等
9.此R2A内的检出菌，有没有革兰染色及芽孢染色
10.不好意思，思维有点跳跃，没有整理好语言。如果每次都是R2A长菌、其他TSA、SDA等都不长，挺奇怪的现象，希望调查出结果了再来这里分享一下，谢谢

夜夜夜夜

超净化工作台环境呢？接沉降菌的碟子长没长？

编号⑨⑤②⑦

你培养基是怎么灭菌的？

夏慕慕

超净化工作台环境呢？接沉降菌的碟子长没长？[/quote]
没有长过，但是倒沉降菌的培养基是胰酪大豆胨琼脂培养基。

夏慕慕

你培养基是怎么灭菌的？[/quote]
按照说明书灭的菌，在121℃灭菌15分钟。

大众日报

可以从培养基干粉、灭菌过程、培养皿器具、纯化水检验微生物时测试环境及操作方法考虑。从你的表述中只能分析，具体的情况我不了解，没法给你答案

夜夜夜夜

那预培养没有长菌的？还有铺的时候是否有污染？装碟子的桶是否灭菌

左司马

八楼说的很完整，一条一条对比着做过去就行了。

编号⑨⑤②⑦

按照说明书灭的菌，在121℃灭菌15分钟。[/quote]
你加长灭菌时间试试，没有看到你操作很难给结论

ccmlhs

一般15分钟容易长菌，30分钟试下！

北重楼

建议你从人机料法环五个角度分析吧

故园修竹

这个还是培养基污染的可能性比较大，你们自己手工浇的皿有没有做预培养。或者阴性对照是否长菌。

夏慕慕

南山月照人 发表于 2016-6-22 10:56
假设这个检验结果是错误的，那么导致这种误差的原因有以下几点：1、检验环境有问题；2、检验用的物料有问题 ...

关于老师您说的第2条，灭菌器我们实验室用的是高压灭菌锅，使用过程会看着，灭菌锅是用嗜热脂肪杆菌芽孢菌片做的验证，然后同一个灭菌锅同时灭过胰酪和沙氏及R2A培养基（它们的灭菌温度时间都一致），胰酪和沙氏的阴性都没有长菌，因此没有怀疑是灭菌器的问题
关于第三条人员问题，如果说是操作不当引起的，培养基整个长菌并不是每次都是，只是最近开始。人员操作、设备都没有改变，如果是人员问题，那为什么有时候长，大部分时候都没有长呢？
关于第4条，我们实验室每一个星期臭氧消毒1次，这个算是环境大清吗？然后每个月的沉降菌和尘埃粒子没有超标过。
第一条决定明天开始去做。
然后万分感谢老师指点，谢谢了

夏慕慕

夜夜夜夜 发表于 2016-6-22 10:51
那预培养没有长菌的？还有铺的时候是否有污染？装碟子的桶是否灭菌

装碟子的桶是和碟子一起灭菌的，请问铺的时候污染是指那一方便呢？能说的详细点吗？

夏慕慕

编号⑨⑤②⑦ 发表于 2016-6-22 12:00
你加长灭菌时间试试，没有看到你操作很难给结论

好的，谢谢！但是灭菌时间的加长会导致培养基的破坏吗？因为是琼脂培养基

夜夜夜夜

夏慕慕 发表于 2016-6-22 13:35
装碟子的桶是和碟子一起灭菌的，请问铺的时候污染是指那一方便呢？能说的详细点吗？

铺的时候没在酒精灯旁啊，手出工作台不喷消毒剂又继续操作了，很多吧。还有碟子和桶灭之前清洗不干净啊，你这个感觉就是碟子本身的问题，预培养应该有长菌的吧

0长风烈马0

环境以及培养基灭菌的可靠性值得怀疑。

编号⑨⑤②⑦

夏慕慕 发表于 2016-6-22 13:36
好的，谢谢！但是灭菌时间的加长会导致培养基的破坏吗？因为是琼脂培养基

没事的，我们一般20min，以前我做过的一个公司他们怕灭菌不彻底灭30min的

hulugourd

楼主，你这明显是培养基本身长菌了啊！你没发现有些菌是长在培养基内部的吗？（你可以再确认一下）也就是说，培养基在液体时就已经染菌了。所以这样是否有方向了？