天花粉蛋白提取

简简罗

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圣剑之心

天花粉蛋白的应用及分离纯化工艺进展
　　摘要：天花粉蛋白（TCS）是我国传统的国药之一，在医学上以治疗引产和异位妊娠闻明，然近有研究表明天花分蛋白对癌细胞DNA 扩增有抑制作用；对HIV 病毒及其他多种病毒有不同程度的抑制作用。有研究表明天花粉蛋白对肿瘤细胞的DNA 有损伤，并导致其凋亡；也有研究表明，TCS 可在细胞表面通过诱导性抑制，减少HIV 病毒的感染几率。本文重点阐述了目前天花粉蛋白的基本结构、应用以及潜在可扩展应用范围，并在此基础上详细说明和对比了各种提取工艺的优劣，对天花分蛋白的纯化和活性关键难点提出了探索性解决方案。
　　关键词：天花粉蛋白研究；临床应用；分离工艺；纯化和活性
　　0 引言
　　天花粉蛋白(Trichosanthin ,TCS) 是从葫芦科栝楼属植物栝楼的根块中提取出来的一种碱性蛋白,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins, RIPs) 。它与双链RIPs2蓖麻毒蛋白(Ricin) 的A 链在一级结构上有56 %的同源性。天花粉蛋白临床主要用于引产等妇科疾病的治疗,另外因其具有N2 糖苷酶活性,能水解真核细胞核糖体的28SrRNA 的4324 位上的腺苷酸的N2C 糖苷键,使核糖体不可逆失活,从而抑制蛋白质的合成。
　　1 天花粉蛋白的分子结构
　　1.1 一级结构
　　天花粉蛋白分子是由247 或248 个氨基酸残基组成的单一多肽链, 其中含247 个氨基酸的为成熟肽，这两种天花粉蛋白的区别在于其C端的氨基酸有Ala 和Met 的不均一性, 即有一种TCS 比另一种在C 端多了一个Ala, 不过这两种蛋白质的性质基本相同。分子量为26kD, 等电点为9.4, 属碱性蛋白。N-末端为门冬氨酸, C-末端分别为甲硫氨酸和丙氨酸,由19 种共220 多个氨基酸所组成, 不含酪和磷。不含二硫键、糖基侧链,也没有磷酸化位点等其他蛋白质修饰位点, 且不含糖的单链核糖体失活蛋白，是一种简单的蛋白质[1]。
　　1.2 二级结构
　　TCS 分子的二级结构由8 段α螺旋和13 条β链组成, α螺旋长短不一, α4、α5、α6 为三段连续的α螺旋, 且α5 与活性中心有关; 13 条β链共组成4 个β折叠层, 最大的β折叠层由6 条β链组成。从整体分子来看,α螺旋相对集中在蛋白质分子内部, 而β链构成的β折叠层则分布在分子表面,这是TCS 分子的显著特点。其中Gln156、Gln160、Arg163和Glu 1894 个最保守的极性氨基酸残基聚集在大小结构域交界处的凹槽中并位于分子表面，它们之间依靠离子健、氢键、范德华力构成天花粉蛋白活性中心，其他几个保守残基Tyn70、Tyn111、 Trp192则起稳定活性中心、支持蛋白质肽链折叠的作用[2] 。
　　2 天花粉蛋白的应用
　　2.1 治疗疾病
　　2.1.1 治疗妇科疾病
　　基于天花粉蛋白本身在妇科上的应用，国内已有不少关于天花粉蛋白在妇科引产上的研究，其最新进展都是关于提高其治疗效率，并减少其生理学副作用上的影响。
　　例如：董少华等[3]将目前常用于异位妊娠保守治疗的2 种药物TCS 与甲氨蝶呤(Methotrexate ,MTX)分别联合米非司酮的治疗效果进行了比较。结果显示,TCS 组的成功率( 90.0%)略高于MTX 组的成功率(89.6%);其β-人绒毛膜促性腺激素(HCG)下降天数和患者住院时间均显著少于MTX 组; 副反应也显著轻于MTX 组。由此,可得出,TCS 具有起效快、疗程短、用药安全简便的特点, 对于异位妊娠的治疗更具有使用价值。
　　闻明[4]进行了用TCSim 治疗未破裂型异位妊娠的临床研究。研究发现,39 例患者中,36例经1 次imTCS 治疗即可治愈,治愈率达92.3%;另3 例患者经2 次im 后也可达治愈。
　　2.1.2 治疗癌症
　　TCS 具有多种药理学活性，对胎盘滋养层细胞具有选择性的细胞毒作用, 故可用于治疗与胎盘滋养层有关的肿瘤,如绒毛癌、人宫颈癌细胞等。而后来的研究证明, TCS对胎盘滋养层的肿瘤及其它多种肿瘤均具有细胞毒作用。
　　周欣阳等人[5]通过对天花粉蛋白诱导黑色素瘤凋亡机制的研究，得出结论:天花粉蛋白对黑色素瘤B-16 细胞DNA 具有较强损伤作用,可诱导其发生凋亡;天花粉蛋白诱导凋亡可能与细胞内钙、ROS 和NO 的增加有关。
　　尤程程等人[6]通过RT2PCR 技术从新鲜栝楼叶片扩增TCScDNA,发现在0～100μg/ ml的浓度范围内,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,rTCS 和nTCS 对HeLa 细胞的生长抑制率逐渐增大,且各组之间差异有统计学意义( P 0.05);rTCS 的IC50 小于nTCS 的结论。
　　2.1.3 抗病毒作用
　　天花粉蛋白作为一种单链核糖体失活蛋白只有活性链而无细胞结合链,只能选择性的进入病毒感染的异常细胞内,而对正常宿主细胞毒性很小,极具临床应用价值。体外实验表明TCS 还可抑制流感病毒、乙脑病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒及腺病毒以及T 淋巴细胞内HIV 病毒的复制,还对单核P 巨噬细胞内的HIV也有抑制作用[7]。
　　2.1.4 在植物病虫害防治中的应用
　　天花粉蛋白可以抑制一些真菌对农作物的侵害，胡苹等发现天花粉蛋白对小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌瓜果霜霉菌、黑曲霉、绿色木霉、烟草赤星病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌和西瓜枯萎病菌等9 种真菌都有抑制作用[8]。
　　除了真菌之外，TCS 对病毒还具有广谱的抗性。转天花粉蛋白基因的烟草对非洲木薯花叶病毒和胡萝卜花叶病毒具有抗性[9]。姜国勇采用叶盘法, 通过根癌农杆菌将TCS 基因和GUS 基因偶联转化番茄,获得了TCS-GUS 基因表达的再生植株, 转基因番茄植株TP3 和TP11 对TMV 和CMV 均表现出较强的抗性[10]。徐琼芳利用基因枪法将TCS 基因转入小麦中,通过田间抗病性鉴定结果表明,TCS 基因能够在小麦遗传背景中进行表达, 并对小麦黄矮病有较强的抗性[11]。
　　2.2 药物学机理
　　天花粉蛋白在某些传统的疾病治疗上以及对病虫害的防治上与病毒和虫类蛋白的基因作用还不明了，所以此处仅抗癌和治疗HTV 的机理研究的进展状况。
　　2.2.1 抗癌机理
　　（1）抑制蛋白质合成。
　　（2）诱导癌细胞凋亡：黄利鸣等人[12]研究了TCS 在体外对人宫颈癌HeLa 细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡效应。结果发现,用TCS 处理后的人宫颈癌HeLa 细胞的生长受到显著抑制, 出现凋亡的特征性改变。
　　（3）通过增强NK 细胞的杀伤活性,提高机体的抗肿瘤活性[13]。
　　（4）调节人体免疫功能：天花粉蛋白具有双向免疫调节作用,既可刺激又可抑制淋巴细胞化反应;既可增强也可抑制体液免疫反应;既可增强红细胞免疫功能又可引起红细胞溶血反应;还可激活补体、激肽系统等从多种途径调节免疫系统。
　　2.2.2 免疫调节-抗HIV 病毒
　　由于 HIV 病毒在感染人体细胞时,细胞表面必须要同时含有一种名为CD4 的免疫分子和另一种具有介导化学诱导作用的趋化因子受体,HIV 病毒才能在细胞中感染、蔓延。上海细胞所的研究小组通过大量的实验发现[14],天花粉蛋白能与人体细胞表面的趋化因子受体相互作用,并导致一系列的细胞反应,从而达到抑制HIV病毒的作用。
　　天花粉蛋白对人体免疫系统具有增强和抑制两方面，王保龙等[15]应用淋巴细胞体外增殖抑制实验,分别对丝裂原ConA,可溶性抗原OVA 及CD3 联合CD28McAb 三种T 细胞增殖系统进行TCS 诱导免疫抑制的剂量依赖性实验。结果发现,低剂量的TCS 不能诱发凋亡,它对T 细胞增殖的抑制不是通过细胞毒性和凋亡引起的。低剂量的TCS(1～500ngPml)对可溶性抗原OVA 诱发的T 细胞增殖具有强烈的抑制作用,对ConA 增殖系统抑制较弱,而对CD3联合CD28McAb 及IL22 增殖系统的T 细胞几乎没有抑制作用,表明TCS 对T 细胞增殖的抑制依赖与APC 的参与。再用TCS 及OVA 同时冲击iBDC 洗净后,激活OVA 特异性的T 细胞发生增殖的能力下降,而TCS 单独冲击处理T细胞后,其抗原特异性的增殖能力并未受到影响,说明TCS 是作用于APC 而非直接作用于T 细胞来抑制T 细胞增殖的。
　　周芸等[16]还通过实验证实TCS针对体外人体淋巴细胞增殖的免疫机制是由CD8Tc2 细胞介导的。而临床研究中，TCS 能显著降低艾滋病病人血液内HIV-1p24 平均水平，增加CD4+t 细胞比例[17]。
　　2.3 基因重组研究天花粉蛋白基因的表达
　　2.3.1 天花粉蛋白基因在原核中的表达
　　聂慧玲等将分离得到的TCS前体基因进行适当改造, 即在编码成熟肽的DNA序列前引进NcoⅠ位点CCATGG,同时将编码的第一个氨基酸残基从Asp 改为Met,或引进NdeⅠ位点CATATG,在第一个氨基酸Asp 前加上Met;另外在编码成熟肽的尾部DNA 序列上加进终止密码子TAG 和BamHⅠ位点GGATCC,并消除原来的NcoⅠ位点。然后,将改造好的TCS 基因重组进pET-2d 或pT7-7 质粒载体,再转化受体菌BL21。用IPTG 诱导进行表达。检测到重组TCS产物约占总蛋白的1/3以上,以溶解和包涵体两种形式存在。重组TCS对蛋白质合成的抑制活力及免疫活性均与天然的TCS 相似[18,19]。
　　2.3.2 天花粉蛋白基因在真核中的表达
　　天花粉蛋白基因不但在原核生物中表达, 同时也可在真核生物中表达。天花粉蛋白基因在真核生物中的表达, 可以显著提高真核生物的抗病虫能力。
　　姜国勇等[20]构建的双元载体pBI121TG24,使TCS 与GUS 基因偶联在35S 启动子的下游, 利用根癌农杆菌介导,先后在烟草、小麦、水稻和番茄中表达, 通过接种烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)于转基因番茄的叶片上, 20 天后未见两个病毒的症状表现。
　　3 天花粉蛋白分离纯化研究现状
　　天花粉蛋白纯化流程主要分为原材料的处理、粗提取、纯化、检验这四个阶段
　　3.1 粗提
　　3.1.1 有机溶剂分级沉淀法
　　溶剂和蛋白质溶液均需预先冷却，然后将有机溶剂由低到高选择几个浓度，每一个浓度所沉淀的蛋白质应立即离心分离，然后在母液中再继续加入有机溶剂至预定的另一浓度，以沉淀另一部分蛋白质，最常用的有机溶剂为乙醇和丙酮。
　　3.1.2 无机盐分级沉淀法
　　常用氯化钠、硫酸钠、硫酸铵等加入至蛋白质溶液中。由于硫酸铵的溶解度较大，对蛋白质或酶又无破坏作用，故最为常用。使用硫酸铵时，因它溶于水后呈酸性，故需注意调节pH 至6～7。
　　3.1.3 pH 分级沉淀法
　　利用蛋白质在等电点时最难溶解的特性，采取改变pH 的方法，使一部分蛋白质沉淀，以达到分离纯化的目的。
　　3.1.4 抽提法
　　李丰[21]等采用栝楼籽抽提天花粉蛋白，得较纯的粗提液：100g 去壳栝楼籽加入1000ml甘油，室温下用组织匀浆机匀浆。匀浆液经过4 层纱布过滤后，在室温下13000 g 离心10min，沉淀用1000 ml 甘油重悬后，在室温下13000g 离心10min。沉淀用200ml 含1mol/L NaCl和1mmol/L EDTA 的10mmol/L Tris·Mes pH6.5 缓冲液制成蛋白体悬液，经超声破碎后，于4℃，53000g 离心20min。取上清液（蛋白体抽提液）用硫酸铵分级沉淀，取60％～100％饱和度的沉淀，对10mmol/L Tris·HCl pH7.5 缓冲液充分透析。
　　3.2 纯化
　　3.2.1 结晶法
　　以中药天花粉为材料中经过丙酮分级沉淀, 最后采用结晶化方法而分离、纯化。或是冷冻干燥得天花粉蛋白。
　　3.2.2 色谱法
　　色谱法包括吸附色谱、凝胶色谱和离子交换色谱等均可用于蛋白质的分离分析凝胶电泳法，此方法分离出的天花粉蛋白纯度较高，并且操作方便，但由于凝胶电泳价格昂贵，所以这种方法一般只用于实验是分离天花粉蛋白，而并没有用于生产。
　　3.2.3 离子交换层析
　　透析后的样品上blue gel 柱柱， 先用 10mmol/L Tris·HCl pH7.5 缓冲液洗去杂蛋白质，然后用含1mol/L NaCl 的10mmol/L Tris·HCl pH7.5 缓冲液洗脱亲和吸附的蛋白质和多肽。合并洗脱的样品，冻干后透析。将经过亲和纯化的样品上FPLC Mono S HR 5/5（Pharmacia）离子交换柱、洗脱、收集活性峰，冻干后透析。在上Superose12 HR 10/30（Pharmacia）凝胶过滤层析柱、洗脱、收集活性峰后冻干，经Sephadex G-25 脱盐后即为纯化的trichokirin-S1样品。
　　3.2.4 亲和层析法
　　植物RIP均以真核生物rRNA为底物，袁惠东、夏其昌等[16]对天花粉蛋白和Cibacron blueF3GA 结合的性质作了研究，差光谱的结果证明二者有特异性结合。在此基础上，建立了一种简便、快速、高效的用Blue Sepharose CL-6B 纯化天花粉蛋白的方法。
　　3.2.5 凝胶过滤法
　　上海生物化学研究所的孙建忠、季瑞华等人[22]用凝胶过滤的方法分离纯化了天花粉蛋白。具体方法如下：天花粉块茎绞碎后，用生理盐水抽提。二层纱布过滤，取滤液加硫酸铵至90%饱和度，静置一段时间，然后离心，收集沉淀。
　　SephadexG-50 柱用0.15mol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.8 溶液平衡。取一定量的天花粉硫酸铵沉淀用上述平衡溶液约2mL 溶解，上样，分部收集。
　　3.3 其它分离纯化方法
　　3.3.1 构建融合蛋白
　　李咏梅等人[23]通过目的构建人表皮生长因子(EGF)-linker-天花粉蛋白(TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-linker-TCS 融合蛋白。应用基因工程技术, 成功地构建了融合蛋白EGF-linker-TCS 的表达载体,表达并纯化了该融合蛋白, 为进一步研究其结构功能关系和肿瘤临床应用奠定了基础。
　　3.3.2 从交联剂上着手，提高生物活性，从而提高应用价值[24]
　　3.3.3 利用基因工程技术
　　在通过 PCR 技术扩增遗传物质DNA 或RNA，之后接在大肠杆菌上。并分离纯化。例如，尤程程等人[25]通过RT2PCR 技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCS-cDNA ,并发现通过利用RNA 反转录最终也能获取天花粉蛋白，并且毒性要比通过CDNA 获得的天花粉蛋白要低很多。
　　3.3.4 用Ni-NTA 树脂亲和层析法
　　马翠丽等人[26]应用上述方法从野生型新鲜栝楼块根中纯化的天花粉蛋白新有效组分的相对分子质量为3338819,产率为1.2mg·g-1;从人工培植型新鲜栝楼块根中纯化的天花粉蛋白新有效组分的相对分子质量为32116,产率为0.3mg·g-1。
　　4 展望
　　综上所述比较上述纯化方法，硫酸铵沉淀法取得天花粉蛋白粗提是纯度较高，但是盐的需求量非常大，并且需要脱而且操作繁琐。丙酮分级沉淀结晶取得天花粉蛋白纯度高，费用低，不含糖。可是：生产周期长，操作复杂，纯化过程损失大。初次结晶毒性高，必须多次重结晶才能使用。色谱法取得天花粉蛋白的纯度较高，并且操作方便。唯一的缺点是价格昂贵。凝胶过滤法方法简单易操作，效率高，生产速度快，基本不含糖，而且此法生产可在凝胶过滤上循环。但是单周期批量小，费用昂贵，不适合大规模生产。亲和层析法的产物较纯，蛋白质活性好。也有生产速率慢，不适合大规模生产的缺点。离子交换层析法利用离子交换层析操作比较简单。但所得产物纯度不是很高，而且蛋白质失活严重，同时耗时大，也由于条件的限制，想要用此法进行工业化生产是不可能的。TCS 具有引产、抗肿瘤、抗病毒尤其是抗HIV 功效，虽然关于它的报道较多，且大部分都是我国研究出的成果，研究所涉及的范围也很广，但是仍存在以下问题：
　　(1)存在着提取纯度不高、蛋白易失活、生产周期长、成本高等缺点。
　　(2)偶有纯度较大的方案，也只适用于小规模生产，且费用及其昂贵。
　　(3)虽然近年来研究者们将精力主要集中在对TCS 药理学的研究上,尤其是癌症的治疗和抗HIV病毒，但是仍然有多处瓶颈，很多现象无法阐释。
　　(4)原料中TCS 成分不高，即使使最佳年龄段（一般5 年）的栝楼块茎也只含6%的天花粉蛋白，产量高的野生型植株还在寻找中。
　　针对上述几个问题，在药理学研究方向上需结合别的学科，并且其研究的进步是以别的学科进步为前提的；野生型植株可以用诱变或基因重组结合植物组织培养的方法替代，但若能找到天然的野生株也好；生产纯化要在达到一定的标准为前提下，找到快捷，适合工业化生产的方法。

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圣剑之心

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心心

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