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本帖最后由 奕安济世生物药 于 2025-4-9 11:00 编辑
在生物医药领域，单克隆抗体（mAbs）和抗体 - 药物偶联物（ADCs）作为治疗多种疾病的重要手段，其质量和稳定性一直备受关注。但是你知道吗？在这些生物治疗药物的生产和储存过程中，一些看似微不足道的因素，却可能对它们的结构和功能产生重大影响。今天，就让我们一起揭开金属催化氧化对 IgG1 单克隆抗体和抗体 - 药物偶联物影响的神秘面纱。
金属催化氧化：不可忽视的影响因素 在生物治疗药物的生产和储存环节中，Cu²⁺ 和 Fe²⁺ 等过渡金属离子可谓是“隐藏的风险因素”。这些金属离子可能来源于发酵培养基、缓冲液、表面活性剂，甚至可能从发酵罐或容器封闭系统中浸出。在氧化还原条件下，它们会产生活性氧（ROS），从而引发 IgG1 单克隆抗体的显著氧化,对药物的质量、安全性和有效性产生潜在威胁。 实验揭秘： 金属催化氧化的影响究竟有多大？ 为了深入了解金属催化氧化的影响，研究人员进行了一系列实验。他们用两种常见的药物相关金属诱导氧化系统，即 Cu²⁺/ 抗坏血酸（ASC）和 Fe²⁺/H2O2 ，对四种 IgG1 亚型的生物治疗药物（曲妥珠单抗、T-DM1、抗 NaPi2b 抗体 和抗 NaPi2b 抗体偶联 vc - MMAE）进行了强制氧化处理，并评估了氧化、分子大小分布、羰基化、Fc 效应功能、抗体依赖的细胞毒性（ADCC）活性、细胞抗增殖和自噬通量。研究人员在以下方面发现了氧化对药物存在的可能影响：
（一）结构和物理化学效应
1.金属氧化位点确认 研究人员通过实验发现，用 Cu²⁺/ Asc 或 Fe²⁺/ H2O2 处理后，通过液相色谱 - 质谱胰蛋白酶解肽图谱检测到，CH2 结构域中的 Met 255（M255）和 CH3 结构域中的 Met 431（M431）这两个位点出现了氧化。Cu²⁺ 在催化 24 小时后，M255 和 M431 的氧化率分别为 19 - 26% 和 6 - 12%；而 Fe²⁺ 在催化 3 小时后 M255 和 M431 的氧化率分别为 43 - 45% 和 24 - 27%。 图1. 通过 LC-MS 胰蛋白酶解肽图分析 Cu²⁺/ Asc 和 Fe²⁺/ H2O2 的金属催化氧化 (MCO) 对 Fc (a) M255 和 (b) M431 氧化修饰的影响
2.羰基化 蛋白质羰基化是金属催化氧化的直接结果。检测发现，Cu²⁺ 和 Fe²⁺ 催化氧化均使所有测试的 mAbs 和 ADCs 的羰基含量增加。其中，Cu²⁺ 催化总羰基化水平增加 57 - 133 倍；Fe²⁺ 介导的催化总羰基化增加 28 - 63 倍。 图2. 在 37°C 下不同时间点，金属催化氧化对 (a) 曲妥珠单抗、(b) T-DM1、(c) NaPi2b 和 (d) NaPi2b-vc-MMAE 的羰基化 (nmols 羰基/mg 蛋白质) 的影响。 (+) 表示与未处理对照无显著差异。误差线表示标准偏差，其中 n = 3。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.005，****p < 0.001
3.尺寸变体变化 通过体积排阻色谱（SEC）分析，发现 Cu²⁺ 催化氧化的抗体在聚集（形HMWs）和碎片化（LMWs）方面有显著变化。以曲妥珠单抗和 T - DM1 为例，在 37°C 下 6 小时后，主峰比例均减少，HMW 分别增加了 18% 和 24%， LMW 分别增加了 25% 和 20%；而 Fe²⁺ 氧化的样品在 HMW、主峰和 LMW 方面变化较小。
（二）功能影响
1.受体结合 表面等离子共振（SPR）检测结果显示，Cu²⁺ 催化氧化对 FcγRIIIa 和 FcRn 的结合影响最大，无法检测到 FcγRIIIa 结合响应；催化氧化 24 小时的样品，FcRn 的结合分别减少 2500 倍；Fe²⁺ 催化氧化在 FcγRIIIa 和 FcRn 结合下降约 2 倍。与抗原的总体结合亲和力基本保持不变，未受显著影响。
表1. 通过 SPR 测量 MCO 对金属催化氧化后曲妥珠单抗与FcRn、FcγRIIIa 和 HER2 抗原结合的影响
2.ADCC活性 ADCC 活性是 mAbs 和 ADCs 生物效价的重要作用机制。Cu²⁺ 和 Fe²⁺ 催化氧化条件均导致曲妥珠单抗、T - DM1、抗 NaPi2b 和抗 NaPi2b - vc - MMAE 的 ADCC 活性降低。其中，Cu²⁺ 氧化条件的影响更大，ADCC活性下降 2 - 9 倍 ；Fe²⁺ 氧化样品的 ADCC 活性下降幅度较小，最多为 2 - 3 倍。 图3.在不同时间点，金属氧化对 (a) 曲妥珠单抗、(b) T-DM1、(c) NaPi2b 和 (d) NaPi2b-vc-MMAE 在 37°C 下的抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的影响。(+) 表示与未处理对照无显著差异的值。误差线表示标准偏差，其中 n = 3。*p < 0.05，**p < 0.01
3.抗增殖活性 以曲妥珠单抗为研究对象，通过细胞抗增殖生物测定发现，Cu²⁺ 催化氧化 6 小时后，曲妥珠单抗完全丧失抗增殖活性 Fe²⁺ 氧化虽保留一定活性，与对照组相比，有大约 4 倍的下降。 表2. 金属氧化对曲妥珠单抗 BT-474 细胞增殖的影响
4.自噬 在表达细胞表面抗原的细胞系中评估 IgG1 生物治疗药物诱导分解代谢自噬的能力，结果表明，无论是氧化形式还是未氧化形式，与未处理细胞相比，均未导致自噬发生变化，未观察到 Cu²⁺ 和 Fe²⁺ 介导的氧化与自噬之间的明确关系。
研究启示：生物治疗药物的质量与安全保障 这项研究为生物治疗药物的研发、生产和质量控制提供了重要的参考依据。它让我们清楚地认识到，过渡金属离子对治疗性 IgG1 单克隆抗体和 ADC 的影响，其氧化产物会产生独特的结构和功能影响。在生物治疗药物的生产过程中，严格控制金属离子的污染至关重要。因为即使是微量的金属离子，也可能在药物的储存和使用过程中引发氧化反应，降低药物的疗效，甚至带来安全隐患。对于药物研发人员来说，需要进一步深入研究金属催化氧化的机制，寻找有效的抗氧化策略，以提高生物治疗药物的稳定性和安全性。
参考文献
MAbs. 2022 Sep 24;14(1):2122957. doi: 10.1080/19420862.2022.2122957
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