小奕说药 | 高浓度单抗切向流过滤的挑战和策略

奕安济世生物药

随着生物制药行业的发展，越来越多的高浓度单抗制剂获批，自1998年后，FDA批准的单抗产品中有大约三分之一是高浓度制剂（>100mg/mL）。46款获批的高浓度蛋白制剂主要应用于免疫、神经、心血管等，这些疾病大多是慢性疾病，需要长期用药。高浓度抗体原液的生产对于提高药物疗效、减少给药体积和改善患者依从性至关重要。切向流过滤是抗体生产过程中的关键步骤，它能够通过浓缩和洗滤步骤去除杂质、浓缩抗体并调整溶液的组成。然而，高浓度抗体溶液的特殊性质，如高粘度和易聚集性，给切向流过滤带来了一系列挑战。因此，制定有效的生产策略对于确保高浓度抗体的质量和产量具有重要意义。

一、难点和挑战

1. 料液粘度高操作压力大

在同一温度下，随着抗体浓度上升，料液的粘度会随之升高。如果浓缩到150-200g/L，蛋白质粘度会攀升到10-50cP，见图1，具体粘度取决于蛋白质本身。低温易引起抗体粘度增加，因为抗体分子的热运动随着温度降低而变弱，分子之间更容易靠近形成相对稳定的相互作用结构，分子活动变得困难，料液的流动性变差，粘度相应升高，高浓度抗体由于分子数量多，相对低浓度表现更加显著。

在料液粘度高的情况下，膜的通道容易堵塞，导致超滤的进料压力高。尤其是过度浓缩阶段，进口压力不断上升，超过最大进口压力限制时，超滤无法进行。

切向流过滤完成后一般会进行0.2μm滤器过滤，以控制微生物负载，由于料液粘度高，过滤压力大，难以正常完成过滤。

图1. 单抗料液粘度与蛋白浓度和温度的关系

2. 通量衰减

高浓度抗体由于具有较高的粘度，流动性差，膜透过性降低。且抗体浓度足够高时，在膜表面易形成凝胶层，对溶剂的通过造成极大的阻力。

3. 易产生聚集

高浓度抗体溶液中，抗体分子之间的距离减小，相互作用增强，容易发生聚集。聚集可能导致产品质量下降，如降低抗体活性、增加免疫原性等。

4. 收率低

超滤膜材质表面通常具有一定的活性基团，高浓度蛋白和膜接触的机会增多，更多的抗体吸附在膜表面。

系统管路的弯曲的连接部位、管径变化的区域以及阀门容易形成液体滞留，膜包内部的结构间隙，流道末端等位置也会留存抗体溶液，无法顺利的排出收集，从而使得整体回收率低。

切向流过滤产品进行0.2μm滤器过滤后，高浓度抗体在滤器的残留会导致收率降低。

5. 辅料浓度偏差

在高浓度抗体超滤过程中，道南效应和体积排斥效应更加明显，原理见图2。

体积排阻效应

超滤膜有特定的孔径分布，对于小分子辅料和大分子抗体，理论上小分子辅料能顺利通过膜，大分子抗体截留，但在实际情况中，辅料存在单体形式或者与抗体聚集体结合成较大尺寸的形式，使得其有效尺寸变大，更易被截留，导致透过液辅料浓度偏低，截留液浓度偏高。另一方面，大量抗体占据了膜孔径有限的空间，导致辅料通过膜孔径的可利用空间减少，间接增加了辅料的体积排阻效应。

道南效应

高浓度的抗体分子自身带有一定的电荷性质，在膜表面附近会与辅料分子竞争因静电作用而形成的有利位置。当抗体数量众多时，会优先占据膜表面一些因电荷吸引形成的“聚集区”，改变了辅料原本按照道南效应应该有的分布情况，导致辅料透过膜的行为发生改变，可能使某些辅料因受抗体的这种“排挤”而难以按照预期透过膜，进而影响其在透过液和截留液中的浓度，让道南效应在高浓度抗体超滤时表现得更明显。

图2. 超滤过程道南效应（左）和体积排阻（右）

二、应对策略

1. 超滤膜的选择

选择亲水性好，低蛋白吸附和通量稳定性好的超滤膜可以减少堵塞和聚集，提高超滤效率和收率。比如使用Pellicon® 3 Cassette with Ultracel® Membrane D Screen和T-Series cassettes with Delta RC membrane。它们不仅具有优异的亲水性，还可以最大限度地减少对单抗的吸附，特殊的筛网结构能够减少压力损失，减缓进口压力过高的现象；同时有效提高传质效果，减缓高浓度下比较容易产生的浓差极化，提高通量。

2. 选择合适的缓冲液

优化缓冲液的类型、浓度和 pH 值等对于超滤过程至关重要。合适的缓冲液可以减少道南效应和体积排斥效应对辅料浓度的影响。例如，置换缓冲液的浓度可为 5-50mm，pH 值为 6.0-7.0。最常见的置换缓冲液比如组氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸钠-醋酸缓冲液等。比如通过优化缓冲液pH，超滤膜回流液和透过液辅料浓度偏差得到消除，见图3和图4。

3. 控制操作温度

控制进入切向流系统料液和缓冲液的温度在常温，一般20-25℃，这样可以避免高浓度抗体在低温时粘度过高。

4. 缩短过度浓缩的操作时间

在过度浓缩阶段，料液蛋白浓度相对较高，是产生聚集风险最高的工艺步骤。可以采取一些方式减少过度浓缩停留的时间，以减少产品聚集。比如通过透过液实际体积计算滞留液的平均浓度，透过液体积到达要求后，立即结束过度浓缩并进行下一步回收操作。而常规的做法是先取样检测循环罐中料液的浓度，确认浓度到达目标后再进入下一步回收操作，一般需要多次取样和检测。但由于浓差极化，超滤膜表面蛋白浓度很高，系统循环液的蛋白浓度较低，导致循环罐料液蛋白浓度并不具代表性。

5. 控制剪切力

剪切力可能导致抗体聚集，因此需要控制超滤过程中的剪切力。可以通过选择合适的超滤设备和操作方式来实现。超滤设备可以选择剪切力相对较小的隔膜泵或转子泵，在过度浓缩时控制流速在较低跨膜压差下进行操作。

添加非还原糖，像蔗糖、海藻糖这类物质，能够改变料液的性质，增加溶液的稳定性，使得抗体蛋白在超滤过程中所处的环境更加“柔和”，减少外部流动带来的剪切力影响。

6. 0.2μm过滤器的选择和冲洗

选择低吸附、尺寸小载量高的过滤器进行料液过滤，这样可以避免过滤后期过滤压力过大无法进行过滤的情况，过滤器尺寸越大料液残留越多，收率相应更低。

还可以采取缓冲液顶洗滤器的方法，尽可能降低蛋白在滤器中的残留，此时需要注意缓冲液顶洗体积，以免影响最终料液的蛋白浓度。

三、结论

高浓度抗体超滤浓缩是一个复杂的过程，面临着多种挑战。通过优化生产策略可以改善高操作压力、通量、聚集、辅料偏差和收率等问题。然而，不同抗体具有不同的性质和要求，因此在实际生产过程中，需要根据具体情况对这些策略进行灵活调整和优化。奕安济世拥有一个成熟的高浓度单抗生产平台，生产团队由一支拥有丰富原液生产经验和知名跨国药企经验的队伍组成，已累计生产高浓度单抗超过15批，成功率100%。

参考文献

[1] Sahin E, Deshmukh S. Challenges and Considerations in Development and Manufacturing of High Concentration Biologics Drug Products[J]. Journal of Pharmaceutical Innovation, 2020(2). DOI:10.1007/s12247-019-09414-3.

[2] Hung J J, Borwankar A U, Dear B J, et al. High Concentration Tangential Flow Ultrafiltration of Stable Monoclonal Antibody Solutions with Low Viscosities[J]. Journal of Membrane Science, 2016, 508:113-126.DOI:10.1016/j.memsci.2016.02.031.

[3] Holstein M, Hung J, Feroz H, et al. Strategies for high-concentration drug substance manufacturing to facilitate subcutaneous administration: A review. Biotechnol Bioeng. 2020 Nov;117(11):3591-3606. DOI: 10.1002/bit.27510.

[4] Miao F, Velayudhan A, Dibella E, et al. Theoretical analysis of excipient concentrations during the final ultrafiltration/diafiltration step of therapeutic antibody[J]. Biotechnology Progress, 2010, 25.DOI:10.1002/btpr.168.

推荐阅读

小奕说药 | 细胞培养液澄清技术简介及技术选择考量

2022-08-25

小奕说药 | 连续生产技术大幅降低早期临床阶段生产费用案例分享

2024-04-16

小奕说药 | 精准打造药品质量追溯“信任链”——CTD质量模块

2024-11-14

小奕说药 | 一张图讲述下游纯化工艺表征

2024-11-27

xqliu

学习了，谢谢提供分享。

好吧那就这样吧

学习学习                  

S星

学到了，非常感谢