耀文解读】综述（2）|一文读懂LNP递送系统赋能CRISPR/Cas9肿瘤治疗应用

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]简单来说，CRISPR/Cas9由Cas9核酸切割酶和引导RNA（gRNA）组成，其中gRNA由crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans ac-tivating CRISPR RNA）构成。crRNA 能够靶向待切割的双链 DNA 序列，并具有短的与tracrRNA互补结合的同源区域，而tracrRNA 则提供与 Cas9 蛋白结合的茎环结构。crRNA:tracrRNA 双链体称为 gRNA，Cas9 核酸酶和 gRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白(RNP)。当crRNA与基因组上的原间隔序列互补配对时，激活Cas9的核酸内切酶活性，在原间隔序列临近基序（Protospacer adjacent motif,PAM）上游的3个核苷酸位置精确切割，引发基因组双链DNA断裂，从而对基因组实现特异性的切割。断裂的双链可通过两种机制进行修复，一种称为非同源末端连接（NHEJ），通过引入缺失突变或者随机插入造成基因序列的突变；一种称为同源重组修复（HDR），通过引入外源的同源序列实现精确基因编辑。

图2：CRISPR/Cas9技术原理二、脂质纳米颗粒递送CRISPR/Cas9的研究进展2.1 LNP递送Cas9/sgRNA质粒

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2017年，有学者在NPG Asia Mater发表文章：《Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy》，他们筛选了超过 56 种试剂，构建了一种新型的基于聚乙二醇磷脂修饰的阳离子脂质纳米颗粒 (PLNP) 的递送系统，该系统可以压缩和包封Cas9/sgRNA质粒，形成PLNP/DNA的核壳结构，在 A375 细胞中的成功转染率高达 47.4%。将 Cas9/sgPLK-1 质粒注射到荷有黑色素瘤的小鼠体内，可导致 Polo 样激酶 1 (PLK-1)显著下调，并抑制体内肿瘤生长 (>67%)。这种方法提供了一种多功能方法，可用于在体外和体内高效、安全地传递 CRISPR/Cas9 系统。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在PLNP递送系统中，首先，Cas9/sgRNA质粒与硫酸软骨素缠结，硫酸软骨素上面携带的高密度阴离子能够使得Cas9/sgRNA质粒结合更多的鱼精蛋白。鱼精蛋白上的正电荷和Cas9/sgRNA质粒DNA/硫酸软骨素复合物上的阴离子相互作用，使得Cas9/sgRNA质粒DNA/硫酸软骨素复合物在鱼精蛋白上发生紧密包装，形成高密度、小体积、稳定的LNP三元核心。由于Cas9/sgRNA质粒DNA/CS复合物携带过量的阴离子及其对携带阳离子鱼精蛋白的屏蔽作用，使得LNP核心带上负电荷，这将阻碍其通穿过同样带有负电荷的细胞膜。以带负电荷的三元复合物（软骨素/鱼精蛋白/Cas9/sgRNA质粒DNA）为核心，用由DOTAP、DOPE和胆固醇组成的阳离子脂质封装（提高脂质层的机械强度），得到带正电荷的脂质/软骨素/鱼精蛋白/Cas9-sgRNA 质粒 DNA (LNP/DNA)。阳离子脂质被认为可以通过静电相互作用轻松进入细胞膜并与细胞膜融合并促进 Cas9-sgRNA 质粒 DNA 的内吞作用。然而，阳离子脂质可能具有细胞毒性，并且可能与血清或细胞外基质发生非特异性相互作用，从而减少细胞内化。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]因此，研究人员最后使用5%聚乙二醇磷脂（DSPE-PEG）对脂质纳米颗粒（LNP）/DNA进行进一步后修饰，得到PLNP/DNA。PLNPs的致密核心结构最大限度地减小了CRISPR系统的尺寸，而PLNPs的阳离子外壳又促进了PLNP-细胞相互作用和PLNPs的内化以及随后的基因编辑。总体来说，PLNP递送策略合理地解决了CRISPR/Cas9系统递送中的一系列问题：质粒的体积、细胞膜的穿透性、细胞毒性和非特异性相互作用。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3：基于PLNP有效递送Cas9/sgRNA质粒

2.2 LNP递送Cas9 mRNA/sgRNA

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]大多数基因编辑体内研究基本上是靠腺相关病毒载体来将CRISPR系统递送至视网膜、骨骼肌或肝脏，然而，AAV 的应用受到其携带能力小、免疫反应、高剂量肝毒性以及缺乏细胞靶向性的限制。近年来有多项研究报道采用非病毒载体来递送CRISPR组分，在肝脏中可实现较高的基因编辑效率（小鼠/大鼠中达到60%），在其他组织中编辑效率发生大大（肺中约 15%，在黑色素瘤中高达约 3%）降低。因此，开发高效、安全的非肝组织递送系统仍然是 CRISPR 编辑治疗转化的重要缺口。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2020年11月18号，Dan Peer教授等在Science Advance发布文章：《CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy》，他们采用新型氨基电离脂质递送 Cas9 mRNA+sgRNA，在小鼠体内实现肿瘤基因编辑，抑制肿瘤生长，提高生存率。这种新型氨基电离脂质共同部分由亚油酸尾链（十八碳二烯酸）和氨基头部构成，中间连接部分可为联胺、羟胺、乙醇胺。研究者评估了靶向GFP基因的cLNP(GFP sgRNA+Cas9 mRNA)，发现L8-cLNP对于GFP基因表达的敲低最为显著。有意思的是，他们还发现MC3-cLNP 在任何浓度下（0.1 至 1.0 μg）都不会降低 GFP 表达。总结来说， L8-cLNP 在体外引起高效、特异性的基因编辑，并且在多种癌细胞系中毒性较低。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图4：基于LNP有效递送Cas9 mRNA/sgRNA

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]PLK1 是有丝分裂所需的激酶，缺乏它会导致分裂细胞中的 G2-M 期细胞周期停滞和细胞死亡。由于神经元是终末分化的非分裂细胞，因此，正常脑组织中 PLK1 的表达量极少。胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，研究人员发现将sgPLK1-cLNP 脑内注射到胶质母细胞瘤组织中，能够检测到激活的 caspase-3 ，通过PLK1 依赖性细胞凋亡效应来触发肿瘤细胞的死亡。在单次瘤内注射sgPLK1-cLNP 后，在小鼠体内可实现高达约 70% 的基因编辑效率，引发肿瘤细胞凋亡，抑制50%的肿瘤生长 ，并将生存率提高 30%。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图5：CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗胶质母细胞瘤（小鼠试验）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]大多数肿瘤，特别是转移性或血液肿瘤的治疗策略需要全身而非局部给药。然而，大多数 LNP 被困在肝脏和其他中央器官中，全身注射后不能被肿瘤细胞有效吸收。细胞靶向基因编辑策略可以增强肿瘤细胞的基因编辑并减少非转化细胞的毒性和编辑概率。研究者采用了一种抗体介导的靶向性的LNP递送策略，借助脂质锚定在LNP表面的单链抗体scFv可识别大鼠免疫球蛋白Fc受体，从而产生表面包被有细胞靶向性抗体的LNP。在卵巢癌细胞中高度表达表皮生长因子受体（EGFR）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]因此，研究者在LNP表面包被anti-EGFR抗体，可实现卵巢癌细胞的靶向性递送。在携带OV8-mCherry肿瘤的小鼠腹膜内注射包被anti-EGFR抗体的 sgPLK1-cLNP ，可实现高达约 80% 的基因编辑效率，抑制肿瘤生长，并将生存率提高 80%。这些发现表明，靶向性cLNP 可能有助于播散性肿瘤的靶向治疗。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图6：LNP偶联单链抗体实现靶向递送

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]此外，也有研究者尝试使用无机纳米粒子和多聚物纳米颗粒来递送CRISPR系统，例如，有人将金纳米颗粒（Gold nanoparticles）与谷氨酸肽标签 (E-tag) 改造的 Cas9 蛋白和 sgRNA 共同组装成纳米组件，以实现高效的直接细胞质/核 RNP 递送。