小奕说药 | 关键质量属性（CQA）评估（3）：非糖基化重链

奕安济世生物药

单克隆抗体两条重链Fc区域通常各存在一个N-糖基化修饰，最常发生在CH2区共有序列（Asn-x-Ser/Thr，X除脯氨酸的任意氨基酸），对单抗的结构和功能具有重要影响。在对IgG-Fc晶体结构研究时发现，寡糖会被包裹在两个CH2结构域内，糖型结构和Fc结构域存在多个疏水性相互作用，这表明糖型对维持单抗的构象十分重要[1]。若无糖链存在，Fc的CH2结构域会稍微扩大，导致在分子排阻色谱中其洗脱时间表现稍提前, 在热加速实验中表现为更敏感且容易聚集[2], 并且其ADCC和CDC效应消失[3], 对蛋白酶敏感性增强而不稳定[4]。由此可以看出重链的非糖基化对抗体药物的安全性和有效性具有潜在的隐患。

以下我们将通过既有知识，对一般情况下的非糖基化重链对于药物的安全性和有效性的影响评估进行论述，并通过PQAA评估工具进行风险评分（评估工具在往期的文章中有过介绍，参见[color=var(--weui-LINK)]《小奕说药|关键质量属性（CQA）评估（1）：蛋白质聚集》），最终确定非糖基化重链是否属于CQA。需要说明的是，依据既有知识的评估结果无法替代具体产品的实际情况，所以这里只是一种评估演示。

一、安全性评估

与糖基化抗体相比，不含寡糖的抗体表现出构象变化、稳定性下降、聚集倾向性增强和效应功能几乎完全丧失的现象。但据文献报道，在生物制药制造过程中，非糖基化的不稳定性是可以控制的，比如非糖基化的IgG1抗体也在阳离子交换树脂上强烈聚集，但这种效应可以通过增加缓冲液的pH值或离子强度，或通过添加柠檬酸盐、甘氨酸或精氨酸来降低[5]。并且在人IgG中发现了极低水平(0.1%)的非糖基化。临床经验显示非糖基化抗体不具有风险[6]。因此对安全性评分为“1无关”。

二、有效性评估

研究表明，糖基化是调节Fc效应功能的关键因素，影响抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)等[7]功能。在生物治疗中，通过控制细胞培养过程去除α-1,6连接的核心岩藻糖可以增强ADCC。CDC的活性也被认为受N-糖基化的影响。这是通过补体成分C1q与单克隆抗体Fc区结合从而激活启动补体级联反应[4]。因此糖基化的去除对效价评分为“7重大”（适用于糖基化影响分子作用机理的产品）。

已知糖基化对PK/PD影响很大，例如末端半乳糖具有更短的血浆半衰期[8]。但是非糖基化对抗体半衰期的影响不能一概而论，因为有的研究表明半衰期会降低[9]，也有的显示半衰期无变化[10,11]。单克隆抗体ALD518（酵母中产生的人源化抗人IL-6 IgG1）证明了无糖基化IgG具有正常PK的临床证据。在一期临床试验中，ALD518的循环半衰期为20-32天，与正常人IgG1的半衰期一致[11]。因此可以认定糖基化的去除对PK评分为“3微小”。

三、风险评分

综上，依据既有知识并采用PQAA评估工具，对非糖基化重链的最终风险评分为7分（详见下表），因此非糖基化重链属于蛋白质药物的关键质量属性（适用于糖基化影响分子作用机理的产品）。

参考文献

【1】徐刚领, 韦薇, 罗建辉, 白玉. 单抗药物N-糖基化修饰对结构功能影响及相关药学问题考量[J]. 药学学报, 2020,55(6): 1345-1350 doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-1064

【2】Ryuta W, Makoto M, Nana K. Influence of N-glycosylation on effector functions and thermal stability of glycoengineered IgG1 monoclonal antibody with homogeneous glycoforms [J]. MAbs, 2019, 11: 350-372.

【3】Tao MH, Morrison SL. Studies of aglycosylated chimeric mousehuman IgG. Role of carbohydrate in the structure and effector functions mediated by the human IgG constant region [J]. J Immunol, 1989, 143: 2595-2601.

【4】Krapp S, Mimura Y, Jefferis R, et al. Structural analysis of human IgG-Fc glycoforms reveals a correlation between glycosylation and structural integrity [J]. J Mol Biol, 2003, 325: 979-989.

【5】Hristodorov D, Fischer R, Linden L. With or without sugar? (A)glycosylation of therapeutic antibodies. Mol Biotechnol. 2013 Jul;54(3):1056-68. doi: 10.1007/s12033-012-9612-x. PMID: 23097175.

【6】Hongcheng Liu, Gomathinayagam Ponniah, Hui-Min Zhang, Christine Nowak, Alyssa Neill, Nidia GonzalezLopez, Rekha Patel, Guilong Cheng, Adriana Z Kita & Bruce Andrien (2014) In vitro and in vivo modifications of recombinantand human IgG antibodies, mAbs, 6:5, 1145-1154, DOI: 10.4161/mabs.29883

【7】Chan AC, Carter PJ. Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation. Nat Rev Immunol. 2010;10:.301–316.

【8】Zhang L, Luo S, Zhang B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 2016;8(2):205-15. doi: 10.1080/19420862.2015.1117719. Epub 2015 Nov 24. PMID: 26599345; PMCID: PMC4966609.

【9】Wawrzynczak, E. J., et al. (1992). Blood clearance in the rat of a recombinant mouse monoclonal antibody lacking the N-linked oligosaccharide side chains of the CH2 domains. Molecular Immunology, 29, 213–220.

【10】Hristodorov, D., et al. (2012). Generation and comparative characterization of glycosylated and aglycosylated human IgG1 antibodies. Molecular Biotechnology. doi:10.1007/s12033-012-9531-x

【11】Mease, P., et al. (2012). A phase II, double-blind, randomised, placebo-controlled study of BMS945429 (ALD518) in patients with rheumatoid arthritis with an inadequate response to methotrexate. Annals of the Rheumatic Diseases, 71, 1183–1189.

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