小奕说药 | 电荷异构体的馏分收集（IEX-HPLC法）

奕安济世生物药

单克隆抗体在生产及存储过程中会由于抗体分子自身性质、环境应力、储存方式等因素，而发生复杂的翻译后修饰，如氧化、脱酰胺、糖基化、C末端赖氨酸切除、N末端焦谷氨酸化、降解/聚合等，造成抗体在电荷分布方面高度的异质性。电荷异构体的产生会影响抗体药物的结合能力、生物学活性、免疫原性以及结构稳定性等，进而影响抗体药物的药物代谢动力学、安全性和有效性。电荷变化的复杂性常常给评估完整的电荷变化概况带来巨大的挑战。

目前，有多种方式（IEX-HPLC、FFE、icIEF等）对电荷异构体进行馏分收集，从而进一步对产品进行表征。奕安济世生物药业理化分析平台具有成熟的IEX-HPLC馏分收集技术，可获得较高的目标收集组分含量，馏分收集纯度1（IEX-HPLC）可达85%以上。收集装置如图1所示，主要是由HPLC和馏分收集器串联组成。

图1. IEX-HPLC馏分收集系统

为提高馏分收集效率，前期一般需要在所用原始分析方法（IEX-HPLC）基础上进行优化，在保持主洗脱梯度程序不变的情况下，缩短方法的平衡时间，增加进样质量。其中，在不改变进样器定量环体积基础上，通过叠加多次进样然后一次洗脱的方式以增加进样质量，可大大提高目标组分的收集效率。图2展示了不同进样质量的CEX-HPLC色谱图，单次进样/洗脱的抗体质量可达9 mg。

图2. 叠加进样及收集区域

为了提高目标组分的收集效率，采用进样9 mg的抗体质量进行馏分收集，收集区域如图2（下）所示。将盲收2得到的馏分样品结合二次精制的方式，再经系列换液、浓缩，最终得到的目标收集组分经CEX-HPLC检测图谱如图3所示，馏分收集纯度见表1。其中第二个碱性峰的（Basic Fraction 2）由于发生N端焦谷氨酸环化，导致其收集纯度降低，其余馏分收集样品纯度可达90%以上。

图3. 馏分收集样品CEX-HPLC检测结果叠图

表1.  馏分收集纯度

馏分收集样品的纯度达到后续表征研究要求后，需对其进行储存条件进行稳定性评估。以确保其质量在表征研究过程中，未发生明显改变。馏分收集后的样品将进一步用于表征研究，对CQA评估、工艺变更、产品批次间差异、质量标准制定等具有重要的指导意义。

备注：

1：馏分收集纯度是指用CEX-HPLC检测，每个样品对应符合馏分位置要求，所收集到馏分组分的峰面积百分比。

2：盲收是指在IEX图谱上由于进样量或检测器信号过载导致组分共洗脱，无法确认待收集区域为酸、碱性峰还是主峰的情况下，对有较强检测信号的洗脱区域进行无选择性收集的方式。

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