原液冷冻的影响及解决方案

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为了提高生物溶液的储存稳定性，人们通常将其冷冻保存，但如果对冷冻过程没有充分的了解和正确的设计，则会对原液造成损坏。

冷冻过程可以通过三种机制使蛋白质变性：

（1）低温浓缩（2）冰面变性（3）冷变性

1、低温浓缩

冷冻的目的是将温度降低到溶液完全凝固的程度，从而阻止蛋白质在液态下降解的反应。当溶液冷却时，液体可能会过冷到低于平衡冷冻温度，特别是在小瓶和小容器的情况下。在足够的过冷温度下，冰的成核过程迅速进行，原液迅速冻结。而在大型容器中，冷冻发生缓慢，并且随着液态水转化为冰，蛋白质和制剂辅料逐渐集中在冰晶之间的区域。

在初始冰核转化为结晶后，产品冷却，水不断转化为冰。当这种情况发生时，剩余原液中的水量减少，溶质的浓度增加。这种冷冻浓缩效应将导致蛋白质浓度增加，从而显著增加分子碰撞的可能性。蛋白质分子之间的双分子碰撞可以通过聚集导致蛋白质变性。蛋白质暴露于高离子强度可能导致天然构象的不稳定性。此外，还必须考虑冻结对缓冲液选择的影响。缓冲剂包含在配方中以帮助保持稳定的pH值。然而，在冷冻过程中溶解度的降低和浓度增加，会使缓冲剂选择性结晶，导致剧烈的pH值变化。

——深蓝色斑点表示较高浓度

——可以看到均匀的冻结图像，看不到深蓝色斑点

低温浓缩效应的缓解策略

1.冰锋速度应高于溶质的扩散速度，使蛋白质分子/溶质被冰锋截留。这可以通过结合较短的冻结路径长度和有效的外部传热来实现。

2.增大传热流体与产品之间的温差，加快冷冻速度。

3.尽量减少产品在低温浓缩阶段的停留时间。

4. 使用可控速率技术将冷冻速度控制在已知范围内。

5.使用小型容器进行有效的传热。

6.优化冷冻速度，避免溶质扩散。

7.冷冻过程中不要震荡。

2、冰面变性

通过色氨酸残基的磷光寿命衰减，证明蛋白质水溶液的冻结会由于冰液界面导致二级和三级结构的丧失，使得蛋白变性。在某些情况下，这种变性在冰融化后基本上是可逆的，而在另一些情况下，则会导致大量的活性丧失。

蛋白质在冰液界面变性最小化策略

1.避免过度过冷，导致过冷成核和较小的冰晶。

2.避免使用干冰或酒精以及液氮浸泡等不可放大的快速冷冻方法。

3.优化冷冻速度，以实现低冰表面积。

4.研究配方成分的使用，以避免表面相互作用。添加防冻剂和表面活性剂，可大大减弱甚至消除干扰。

3、冷变性

虽然某些蛋白质可以在冷冻过程中保持活性，几乎测量不到活性损失，但有些蛋白在冷冻过程会不可逆地失活。正如蛋白质在高温下经历热变性一样，蛋白质也会在非常低的温度下自发展开，称为“冷变性”。这在一定程度上是因为冷冻过程中产生了不合适的环境。

通过对临界冷冻参数的优化，可以消除或减弱冷冻浓缩效应以及冰液界面吸附引起的蛋白质变性。

减少冷变性的策略：

1.增加冻融稳定性的配方添加剂

（a） 热力学稳定剂

（b） 低温保护剂

（c） 玻璃态形成物质

2.快速液固相变

后期，我们将为大家带来可控的冷冻技术方案，敬请期待

徐经理   13916319507   

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谢谢分享，学到了