细胞培养-成团成片统计交流

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临床检验样本库研究组，我们无外力培养优势是，正常顺利培养，冻复苏存传统方案要不能满足要求，可来信告知（准备走dmso方案，还是玻璃化干细胞方案），我们给出备份方案可验证，技术储备统计难养细胞时间较长，可能会有些优势，国外样本库自动化研究方向可深入讨论，试剂与技术可行性，我们是建系目的开发试剂已有七年技术储备，头几年还找不到方向，只是实战应用统计可行性，通过国外样本库研究资料统计，冗余试剂开发配套自动化很有优势。

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免疫细胞建系参考

1：建系目的，含血清方案（重复容易,成本低）结合简易单克隆法，克隆单细胞确保目的细胞，主单克隆群体增殖无影响（分出细胞在做鉴定）
2：避免外力（机械力，化学力）影响建系，国外样本库自动化研究已有案例介绍）
3：聚丙烯管进行进行细胞处理和分选，15%FBS+1640
4：可讨论最佳温度（4°C或15°C或室温）
5：低俗离心（国外临床样本库研究，没有拿到具体数据），国内经验谈，1000转（10分钟内）
6：冻存复苏：目前细工最优方案，DMSO8-10%+FBS40-90%,冻存前我司优化胰酶消化后成单个状态，比吹打成单个活率大大提升。新型冻存液有一年以上冻存复苏案例的，我们可配合免费推广。

离心机研发生产厂家，纳米磁珠分选免疫细胞研发生产厂家，路过可深入讨论，要能共享FAQ,我们可共享验证。
如流式告知型号，最佳培养基和细胞最佳浓度我们做些最佳方案推荐。
死细胞验证：低浓度碘化丙啶（PI），鉴别染料7-AAD告知厂家货号，我们统计下各厂家优略后，讨论试公布参考结果。
自动化培养需冗余试剂配合，我司建系目的，技术老师路过多多支持。

二倍体建系考虑马血请，猪血清方案的用户，高质量及稳定货源，我们试用建议做备份体系。痛点可提前讨论。预实验先行。

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20241105
类器官(消化），售后统计应用参考与讨论
无血清方案成团成片消化参考：用户悬浮培养无血清培养体系，消化备份方案参考（无动物源成份要求）
1：EDTA单独消化
2：培养过程中解离培养基
3：无酶消化液。
后面具体问题具体分析，就无酶消化后，细胞呈糨糊状分析，是无血清方案后培养特性，细胞缓冲能力弱，一是营养耗尽后，细胞马上呈现弱化现象，避免应考虑提前换液，无血清大部分厂家还是研发为主，替代血清还有待提高。无酶理论上对细胞损伤很小，结合无血清，要考虑细胞缓冲能力。

就以上问题，细工方案，先含血清大量培养后，在上无血清会好很多，充足细胞量是摸无血清条件不错的方案，细胞冻存复苏也涉及研发过程较重要环节，可就具体案例细胞讨论，种子库、工业应用，临床样本研究，对冻存复苏挑剔各类问题汇总统计中。

优化胰酶结合冻存复苏应用参考
冻存前细胞处理（特别是成团成片，易团聚类），细工胰酶对细胞膜无损，化学力消化后成单个状态，在执行冻存复苏程序降温，细胞活率大大提升，各类特点不一（免疫类团聚，神经胶质类团聚，腺类团聚）随各有各的特性，也有些总体规律性，例如上清回输，适合大部分团聚成团成片，要结合含血清无血清培养特点。

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自动化培养冗余试剂开发案例介绍-黑点、生长慢解决思路方法参考

问：
想请教一下各位老师，图里的是293t细胞，红框标识的地方细胞内有小黑点，而且会动，请问这可能是什么，有什么处理方案吗；当前尝试使用左氧当作支原体处理，目前看来无效？
就是怀疑细胞里面的黑点是某种胞内微生物污染
准备检测一下



答：
黑点讨论：用瓶用皿，生长时间多久，胰酶浓度可低些，提高血清浓度，换成瓶进口的，恢复下，养几天试试，要是生长时间长，上述很管用，血清厂家货号，培养基效期列出下，要是时间太长，补谷氨酰胺，或换成叫新批次，按上述做下，如有条件换成大牌子进口的，养几代会有改观。如有效果来信告知。我们统计黑点，生长慢问题

黑点发生，培养液不新鲜，血清营养含量不够，生长慢后，皿容易PH变化大，导致越来PH变化越大，过酸或过碱，瓶能改善，并能恢复，参考。我觉得检测意义不大，上述要列出来，问题就能很快排除，培养基都差不多，后面要长养细胞，叫新鲜要对厂家说出来，或者自己有补救办法。说的不对处请海涵。

验证后，再出现黑点问题，能很快排除，目前几个组按上述验证，用户还比较满意。

低浓度胰酶，0.05是个好习惯，消化时间虽然长些，膜无损更重要，正规库几个老技术都推荐，也不反驳同学用，0.25我们做自动化培养冗余试剂开发，胰酶浓度很关键。

0.25消化后的细胞，传代后会先恢复细胞膜在生长，细胞工厂大面积消化，我们有统计，还有就是成团成片类特性细胞，0.25容易把外面消化成泥，里面也没消化透 ，并伴随细胞老幼状态，上皮类团聚尤甚，293就是上皮类案例，老幼情况出现，细胞状态不一，难做后面实验，参考

避免建议，小克隆形成后，就用低浓度胰酶，消化成单个传代，大面积在消化，老幼问题用以出现，案例细胞，mdck

总结：类器官、人造肉、自动化培养、建系、微流控制培养等应用，长久看，各种培养中问题都要解决或者有突破，细工生物在这方面，根据自己能力财力，推荐含血清方案为主(容易实现，也是无血清培养条件验证大量细胞拿到验证前提，即便是临床研究应用目的，细胞量也是摸无血清培养条件前提)目前国内已有公司推出把类器官培养100培养工作一天完成成瘤成球，延展讨论以下体系培养中问题统计

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自动化培养（微流控制培养）配套冗余试剂包括
增强贴壁试剂说明书：自动化培养中促细胞贴壁，工业生产应用维持培养增加细胞产物等， 研发历程及工业案例
优化胰酶：对细胞膜无损，
解离培养基：贴壁细胞驯化成悬浮等应用
自动化转染试剂：毒性低，可通过自动化反复转染
自动化冻存复苏相关统计：临床样本研究高活率要求，配套自动化摸出精准SOP

以上案例验证最简单办法，找到痛点问题中类似可相通理论案例，多面验证确保方案可行性高，例如上面胰酶案例，我们是通过细胞工厂超大面积工业生产用户得到的实战数据，结果是提高用户产能效价，胰酶敏感细胞验证佐证，更多数据支撑，也是下面黑点，生长慢所有实验室都会面临的问题，找几个实验室一起拿到可行数据，对冗余理解要更全面（国外较大公司新品胰酶已经在EDTA加大含量，加快消化试剂，可种子库应用来讲，还要有更多数据支撑，化学含量增加对种子库影响面也要长期评测），膜损伤，机器对接等还要有更多部分考虑，无血清体系消化还有不同，该体系容易消化后成泥，就不能考虑膜受损部分，应该考虑无血清研发培养特点，要走其他思路解决-详细可告知问题详细讨论。可行方案验证。我们后面目的是建系，所以对试剂部份，都要有几年以上验证，才稳妥。冗余理念一点看法。

自动化培养设备（微流控制线片培养），需PDMS、PMMA连接细胞应用，我们可发增强贴壁试剂验证，2017年以来在相关应用介绍，链接是研发日记形式，就是技术开发人员列出案例及解决思路（验证结果等）

自动化培养中问题统计是我司一直统计的内容，好的问题就是产品开发成功一半心得，该设备比较贵，如您公司或者用户可共享使用该设备（告知地区及要求），我们相关用户群体很多（科研用户居多，也有些兽用疫苗用户），合作拓展更多人员上手实验，拿到更多痛点问题，也是未来潜在用户，从2015年开始PDX、类器官、人造肉、外泌体、细胞力学等相关研究统计用户。这些实验室上自动化难度大，经费，预判未来结果未知等，通过共享解决困惑等。

案例说明
黑胶虫污染统计
2011-12-02T00:00 (访问量:10523)-开始统计-如需要链接可发您
国内黑点，生长慢，成瘤不稳定可参考-结合自动化培养冗余试剂提出理由-细工方案终结方案可讨论，建系、耐药株参考有积极意义。
20230101-20241126-终结该类问题，涉及，培养基新鲜度，血清营养含量、耗材条件-具体可讨论-需列出厂家货号，邮件联系
相关统计关键词：难养各类系问题统计、 成团成片、简易单克隆、耐药株构建、冻存复苏、含血清救助、细胞工厂工业应用、进口大厂试剂特点，进口耗材统计。

十二年统计后细工方案参考，冗余试剂对自动化培养有积极意义，国内实验室多，培养条件复杂，人员多，问题也多，耐心找到问题中关键点痛点，在后面相关问题中得到实战验证，找到可行方案我们支撑，国内正规库四个库，各类难养细胞重点室，珍贵的痛点问题。大类分细胞系：乳腺癌类，肝癌、胰岛胰腺、免疫悬浮、神经胶质类，耐药株建立。纯国内技术、试剂完成细胞系建立是我们执着的方向，相关国外大厂家前言可行性我们有些建议可通过问题统计讨论。我们走含血清方案为主，无血清前沿也关注。如能兼职完成问题统计，我们可按您要求，共享或不共享统计内容。首家黑点，生长慢解决方案提供商。

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黑点，生长慢，成瘤不稳定组（冗余试剂验证与精准SOP汇总统计参考讨论）
冗余试剂开发需给设备、技术、细胞、水试剂、操作方法多方位融合，可行性高，基础实验要能顺利完成（解决痛点难点）或者提出可行性参考建系，国内五百家实验室，十年细胞培养问题统计，以最常见293案例，开始更多数据技术共享及自动化培养应用中统计开始，近五年细胞工厂应用，配合现在自动化培养、微流控制培养、细胞力学研究一些问题统计，统计更多自动化细胞培养中问题，建系目的，中式工业应用目的，简单易行思路。
以黑点，生长慢，提出细工方案参考，
需长期深入讨论，标注下，为讨论沟通精准性，建议告知详细资料需：
细胞来源，公司，正规库，等
耗材厂家货号
试剂厂家货号
细胞图片，增长描述，问题描述，实验理想目的。
珍贵株需救助的，对自动化培养有积极意义，讨论沟通标注下，我们最有兴趣的案例细胞，我们目的是建系，痛点难点问题更有兴趣，效果明显，成就感也大。
陆续后面会推出，简易单克隆可行性（国内建系为主），冻存复苏挑剔细胞（原代尤甚），自动化转染试剂开发、耐药株建立，缺氧培养是救助不成瘤主要思路（延展工业应用数据储备欢迎合作开发-工业户）相关资料都会发上来。

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总结了关于细胞黑点问题，及解决思路参考。
结论：膜受损后，内物质析出。
培养基效期-谷氨酰胺长期不发挥作用，水质量
血清营养含量
成团成片-细工优化胰酶可很好的解决，
操作习惯，越熟练，操作过快，胰酶损伤细胞膜部分反复快，无修复时间，一段时间后就会使细胞膜破损后，钙化形成。这个问题我们用培养瓶，结合无损消化胰酶，经慢处理，恢复后，可将黑点情况慢慢恢复成正常状态。
上述堆叠在一起，使细胞膜受损严重后，破裂后形成钙化。（瓶修复很重要，避免影响PH变化），修复也就是按上述结合，有我们附件中简述步骤。
发您目的，是为自动化培养-冗余试剂开发做更多技术储备及更多验证，如有效可留言

黑点统计历程
2011年开始统计黑胶虫，国产血清售后为主
2014年：培养基新鲜度，水影响
2017年，工程细胞大面积贴壁细胞培养，对培养基新鲜度，血清营养程度，做多厂家分析，包括耗材。鼠肠原代合作发挥重要作用（建议用户组在国内正规库保存种子）
后期总结各类难养细胞结合分析，用户习惯，常用耗材，结合上述统计逐步推广附件中方案，并开发相关产品：优化胰酶
优化胰酶：宣传销售过程中阻力难度极大，主要是老师习惯性阻力，种子库及工业应用配套促贴壁试剂开发（解决LMH案例细胞）优化胰酶优势明显，
胰酶敏感细胞开始统计：胰岛胰腺类系，原代，及各类难养细胞数据集合分析：乳腺类，肝类，
国产耗材开始大量普及。
2018：冻存复苏相关统计，优化胰酶优势，化学力发挥，复苏后细胞活率明显。
2019：类器官应用胰酶优势，提出先建系在规模培养后成球方案。多组建议用作备份方案，2024年案例组胰岛胰腺原代上皮可顺利培养及传代，（建议用户组在国内正规库保存种子）
2020：建议合作国内血清厂家，建纯国内技术，试剂建系合作。
2021-2023：各类黑点应用案例储备：HEPG2,胶质类，上皮类，SV40,腺类，神经类
202412月正式推出黑点案例解决方案，定义含义：可把黑点养没，耐药株为首要案例细胞(类器官我司走含血清建系培养路线，2020年开始统计总结，耐药株建立，将细胞换成细胞球，不就是药筛吗）

十二年统计后细工方案参考，冗余试剂对自动化培养有积极意义，国内实验室多，培养条件复杂，人员多，问题也多，耐心找到问题中关键点痛点，在后面相关问题中得到实战验证，找到可行方案我们支撑，国内正规库四个库，各类难养细胞重点室，珍贵的痛点问题。大类分细胞系：乳腺癌类，肝癌、胰岛胰腺、免疫悬浮、神经胶质类，耐药株建立。纯国内技术、试剂完成细胞系建立是我们执着的方向，相关国外大厂家前言可行性我们有些建议可通过问题统计讨论。我们走含血清方案为主，无血清前沿也关注。如能兼职完成问题统计，我们可按您要求，共享或不共享统计内容。
有需要验证老师，可留邮箱发您参考步骤

补充内容 (2024-12-11 08:01):
简单验证：慢操作，慢培养，进口试剂耗材，瓶，看清效期四个月上生产日期补谷氨酰胺，血清种子库级别（稍差回复效果慢）大牌子猪牛胰酶来源最好，0.05-0.02浓度，恢复传几代就可以，有效果来信，我们冗余试剂开发

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膜片钳细胞培养痛点统计-细工生物
1：心肌，神经元 原代离体处理讨论，细工备份方案参考，
2：胰酶敏感细胞开发得优化胰酶，可送试用比较。要点是对细胞膜无损，该项对后面膜片钳应用会表现更好细胞状态（该理由可参考我司黑点，生长慢，不成瘤相关解决思路）
3：完全培养基：细工含血清为主，技术储备足，涉及各方面问题都有几套思路解决，无血清方案要求，可先用含血清大量培养后，拿到充足细胞后，在筛无血清方案。
4：冻存复苏：临床样本库研究验证推荐含血清传统方案推荐，无血清要求可通过案例比较式验证（该验证方法建议备份组）
5：各类难养系在膜片钳应用中potocol统计，各类难养系统计实验室痛点准确，相关试剂耗材厂家特点了解，更多技术储备备份。
6：需加药评测的，可参考我司耐药株建系驯化细工方案（有需要讨论用户，标明实验室，联系人名称）该方案优势已与合作组预实验建议百倍，千倍耐药梯度。

细工优势：
1：我们是纯国内技术建系目的（前沿研究类器官，人造肉用户组备份组推荐），对各类痛点问题统计深入，自动化培养冗余试剂，细胞容错试剂范围更宽泛，并可行，对国内实验室培养体系了解（对费用充足与节约实验室都适用，需要长期研究的课题组，种子库还是尽量用到细工方案参考）。
热点痛点优势介绍：细胞中黑点，生长慢，成瘤不稳定，详细讨论后，我们给出参考建议。

happyukl

还是做论文时候养过细胞……好多年了

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schwann cell雪旺(施万)案例讨论-纠细为冗余试剂做更多技术储备，不对处还请老师指正
国内库来源基础
细胞名称         大鼠雪旺细胞；RSC-96
形态特性          神经元样
生长特性         贴壁生长
特征特性          RSC96细胞株是原代培养的大鼠雪旺细胞经长时间培养后自发转化而成的[PubMed:9766530]。2002年十二月提交到ATCC的培养物污染了支原体。其后代通过BM细胞周期蛋白处理21天消除支原体。处理后六周，用Hoechst染色、PCR和标准培养测试进行支原体检测。结果都呈阴性。
培养条件          DMEM-H: Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium (DME H-21 4.5g/Liter Glucose)  10%FBS
传代方法          1:2~1:6传代；2~3天换液1次。
传代情况         
冻存条件          基础培养基+8%DMSO+20%FBS　

该系注意事项-备份方案参考
目的应用，超量培养、类器官上前状态调整、超长维持培养、分化后超长时间培养
关键词： T25 瓶 、 细胞培养摇匀、  DPBS(不含钙镁) 、成团成片（优化胰酶）、培养环境及细胞需要每日观察、酸碱-细胞中培养基颜色观察要仔细-问题沟通中偏黄，偏紫要描述准确，

1：建议长期做下传统DMSO与无血清冻存比较，细工推荐DMSO,用量8% ，程序降温建议用泡沫盒方法，统计意义，后面自动化应用、对冻存挑剔细胞（耐药株系、原代自建系、工业户种子细胞）、了解胰酶特点辅助冻存的用户的来信注明（发地址联系人，注明案例细胞名称），复苏后碎片过多的用户建议参考细工传统方案。优化胰酶消化虽然费时，可复苏后高活率，大大节省整体实验时间。复苏后细胞活率还说明细胞状态更好。
2：含血清为主，ATCC疑问讨论(支原体污染过细胞）,通过黑点，生长慢优化后救助，慢培养路线，瓶培养后，避免皿-PH变化快,3-X天以上增殖的系，瓶方式能理解的用户，应用前建议提前关注几个重要参考排查，排查培养箱设置、培养基成分，以及培养器皿是否异常。（黑点问题不见得是污染，更多案例统计后，在公布参考）原代含血清方案，熟练实验室及国内库，概率都是4-7天都可顺利长满并传代，也是我司力推含血清理由，无血清部分考虑影响因素更多，需讨论可详细先告知细节。
3：需超量雪旺细胞，分化后维持培养（或类器官应用的），更好状态，可试试细工方案及试剂，
4：消化，雪旺壁厚，对膜要求高，细工胰酶又明显优势，该株转染前、冻存前、膜片钳等实验使用后，避免细胞膜损伤，后面实验会更好（建议做细工方案备份组）。常规胰酶浓度0.25消化需8-9 min以上的，细工胰酶后面培养细胞质量会有优势明显，MDCK、上皮、细胞壁厚细胞，成团成片，iPSC含血清方案，细工优势在，不怕消化过，细胞膜无损，在实验中，可同时处理几十盘细胞，该方案应用前，自己要做预实验，并建议用胰酶敏感细胞验证，拿到预实验数据，后面相关很多实验都会用到，并是较关键步骤，细工在自动化培养冗余试剂开发中，试剂容错能力，对细胞质量后期实验目的超量，维持培养及要求高的实验。

该细胞需特别注意:
RSC96 细胞生长形态为神经元样长梭形形态，细胞生长至过密时细胞会变成圆形细胞，细胞生长至80%即可传代。细胞对血清质量较为敏感。

细工不同建议与后面预实验参考验证：通过胶质类细胞规模培养，工业用户对培养基成本要求高用户，上清部分回输可比全新完全培养基增殖明显快，也相应减少成本费用，后面自动化培养-冗余试剂开发还有更多问题挑战，也建议用户做预实验组，做备份方法。工业用户胶质类用户可深入讨论规模培养，自动化培养、维持培养等应用。

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类器官相关-2025
-微血管内皮的培养及在医学研究中应用现状，大规模细胞培养的方法，干细胞培养相关的新产品。
1：类器官培养过程中无法实现血管化营养供给。 体外培养类器官的营养来源主要依靠培养基提供，其大小会受到较大影响。 目前类器官培养的适宜大小为直径１００～２００ μｍ，当类器官尺寸较大时，中央区域的细胞面临与外界交换氧气和营养成分的困境，因此随着结构尺寸的增大，细胞死亡的比例也会上升。 目前，多项研究致力于解决类器官血管化的问题，包括建立血管类器官
2：从而构造更拟合人体的类器官模型。 同时，器官芯片的压力、流速可控的灌注系统一定程度上为类器官血管化问题，提供了解决方案。
3：类器官受取材位置及大小的影响，肿瘤整体代表性不足。 目前类器官的取材来源主要包括实体或液体活检、手术切除以及尸检样品，但是这些材料来源相对于肿瘤整体来说较为单一，代表性不足，在反应肿瘤异质性方面说服力不够。 由这些样本构建出的类器官不能代表肿瘤的整体情况，因此其药物反应的真实性难以确定。
4：与体内生长情况不同的是，某些肿瘤类器官体外生长速度反而不及组织来源的健康细胞，因此这类肿瘤类器官在培养的过程中很有可能失去生长优势，被正常类器官取代。
5：器官芯片倒是符合各实验室研究类器官初步吻合也合适的研究，用“芯片”模拟人体器官功能 简单来说，器官芯片是一种微型设备，它通过在芯片上构建类似真实人体组织的三维结构，用以模拟具体器官的功能与反应。与传统动物实验相比，器官芯片具有更高效、更精准、更具伦理优势的特点。这项技术的发展，有望彻底颠覆当前药物开发、疾病研究和个性化治疗的方式。生物医学和微纳米加工技术的发展，器官芯片从概念走向实践已成为可能。
高度精密制造工艺、高质量活体细胞来源以及跨学科协作等问题，都需要进一步攻克。更加意识到提高医疗效率、加快药物研发的重要性。而以往依赖动物模型进行试验，不仅周期长、成本高，还存在伦理争议。相比之下，器官芯片能够显著缩短新药研发时间，同时降低失败风险，高度精密制造工艺、高质量活体细胞来源以及跨学科协作等问题，都需要进一步攻克。细工在自动化培养中冗余试剂开发这个点做些微小的面开发产品，
从癌症靶向药物测试，到罕见病的新疗法探索，再到个性化治疗方案制定，每一个环节都可能迎来革命性的变化。甚至有专家大胆预测，在未来十年内，大量复杂的人体实验或许都能被“替代”为更安全高效的模拟测试！

脑类器官在药物研发中的研究进展
线粒体定位Mito-DsRed2-Hela稳定细胞株说明书
探针
肿瘤模型
肿瘤机制
肿瘤机制:亲代肿瘤的基因组、转录组、蛋白质组等多组学特征,细胞系模型所缺乏的异质性
临床前模型
肿瘤类器官；精准治疗；类器官生物样本库
肿瘤细胞系（ ｐａｔｉｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｕｒｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，ＰＤＣｓ）
患者来源肿瘤异种移植瘤（ｐａｔｉｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ，ＰＤＸｓ）
类器官模型（ ｐａｔｉｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ，ＰＤＯｓ）
患者来源的肿瘤类器官（ｐａ⁃ｔｉｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ， ＰＤＴＯｓ）

酶水解的方式可能会导致细胞间的相互作用减弱甚至消失，酶解离方式相比 机械切割法保留了组织和肿瘤微环境中细胞成分的天然结构，从而调节类器官的形成和表型。 但这种方法的缺点在于机械切割所产生的组织碎片会使被包裹细胞的胞外环境不均匀，包括不均匀的氧浓度和营养梯度。 钝性的组织切割也会损害肿瘤样本，使得最后所得的活细胞数量减少
配套品各厂家分析，研发生产提前技术储备
基底膜提取物（ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｘ⁃ｔｒａｃｔｓ，ＢＭＥ）将其包裹，并接种于孔板内形成穹顶样ＢＭＥ 是从小鼠Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ⁃Ｈｏｌｍ⁃Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）肉瘤细胞中纯化出来
的一种可溶性基底膜，类 似 的 物 质 还 包 括 Ｍａｔｒｉｇｅｌ 和 水 凝胶［６］常见的因子包括 Ｗｎｔ 通路激动剂（ Ｗｎｔ⁃３ａ、Ｒ⁃Ｓｐｏｎｄｉｎ １），ＴＧＦβ 通路抑制剂（Ａ８３⁃０１、Ｎｏｇｇｉｎ），ＭＡＰＫ 通路抑制剂（ＳＢ２０２１９０）以及生长因子等---有兴趣开发相关产品可留言讨论，我司在细胞质量一致性用在生产中，细胞规模培养，维持培养，产物上游研发有很多优势。



１） 浸没培养法，这是类器官培养模式中最为经典的方法。 该方法广泛用于各种肿瘤类器官的培养中，即孔板中包含类器官的胶体，凝固之后再加入无血清的培养基完全淹没。 这种培养方式被用于早期类器官模型的开发，成功培养出了
胃［７］、结直肠［８］、肾［９］、胰腺［１０］、肝脏［１１］ 等类器官。
２） 气⁃液交互培养法，分内外皿两个部分，即内皿放置类器官，外皿放置培养基，且培养基的液面高度不高于类器官高度，这样既可以通过直接暴露于空气中从而促进气体交换，又可以通过底部的小孔吸收营养物质供类器官生长。 这种方式有利于保留免疫微环境中部分免疫细胞的成分，为研究肿瘤免疫微环境的调控机制及后续的癌症免疫治疗提供了良好的体外模型.
３）不同细胞共培养，这是一种在同一培养环境中直接或间接培养多种不同细胞类型的方法。 肿瘤微环境的重塑是目前各种模型研究中的重点和难点，共培养模式的提出一定程度上解决了这一难题，如肿瘤类器官与免疫细
胞、成纤维细胞共培养使得其更加真实地模拟体内肿瘤生态位，还原体内药物反应。 此外，还可根据不同的研究目的设计不同细胞和类器官组合的共培养体系，更加高效地进行研究。

Ｈａｎｓ Ｃｌｅｖｅｒｓ 团队通过患者来源的大细胞神经内分泌癌（ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＬＣＮＥＣ）类器官的建立确定前神经转录因子（ＡＳＣＬ１）是 ＬＣＮＥＣ 对 ＢＣＬ⁃２ 抑制剂治疗反应肿瘤类器官用于抗肿瘤药物的高通量筛选

肿瘤类器官样本库的建立将成为新药临床前研究的有力工具类器官模型以其遗传特征稳定性、多克隆、反应供体病理生理特征以及可传代的特征受到广泛关注。 以肿瘤为例，消化系统和生殖系统建立了最多的生物样本库。 其中，结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胶质瘤和膀胱癌的类器官培养技术最成熟。

接近体内病理生理状态，提高其模拟的精准性。 此外， 基于类器官理论， 新的模型如器官芯片［２４］和 ３Ｄ 3D生物打印［２５］得到进一步发展，为建立更好的模型提供新的方案。
３Ｄ 培养-细胞嵌入到三维基质中，
肿瘤类器官生物样本库
移植瘤-痛点统计

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成瘤难痛点关键词
接种前分析：细胞名称，生长特性，堆叠，成团成片，粘连，化学力-机械力解离质量（酶解-钝解差别），最好做转染后结果参考，冻存复苏后活率参考，
接种后分析：不成瘤，炎症、空洞、先成瘤后消失

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优化胰酶的关键实验应用参考讨论-细工生物20250108
转染前消化、冻存前消化、成瘤前消化、耐药株处理、种子库细胞痛点可讨论
使细胞单个避免机械力-钝力损伤，生长特性团聚，成团成片，堆叠特性，统计历程，
2012-2025年开始统计免疫细胞：细胞系，原代等、常用系THP-1、NK92、JURKAT、等
2015-2025年全套细胞培养水试剂种子库级别推出后，各类难养细胞系统计，肝类，胰岛胰腺类、乳腺类、卵巢类、神经类、上皮类归纳共性、PDX（辅助建系同做）、肠类原代建系（该案例用户不在国内库存细胞，不能公布）
2018-2025年开始统计：成团成片-各类细胞特点
2019-2025年统计各类团聚之间关系，腺类、神经类、（胰岛胰腺原代-胆管互作用建系，肝建系-酮元素），类器官-建系思路开始。胰岛胰腺原代（该案例用户不在国内库存细胞，不能公布）
2020-2025年：类器官-建系思路为主，2024年已有公司推出同类方案
团聚：区别原始生长特性，与试剂、技术、手法、生长中其他因素引起的，为准确区分问题，简单方便找到痛点，建细胞系是最终找到培养过程中痛点问题全部通过各类问题验证，已提出常见痛点问题细工适合国内体系的方案，黑点、生长慢、不成瘤，简易单克隆方法，耐药株建立痛点参考、成瘤不稳定-细胞培养层面解释（不成瘤，空洞，消失）
种子库级别应用参考、结合以下几种实验优势结合整体-处理成团成片、堆叠，使细胞单个避免机械力-钝力损伤的转染前消化、冻存前消化、成瘤前消化、耐药株处理、种子库细胞等

动物模型-不成瘤案例-胰酶拓展验证应用
成瘤难痛点关键词
接种前分析：细胞名称，生长特性，堆叠，成团成片，粘连，化学力-机械力解离质量（酶解-钝解差别），最好做转染后结果参考（明显的转染效率提升，基础细胞质量提升），冻存复苏后活率参考（明显的复苏活率提升，基础细胞质量提升），膜片钳应用对细胞膜保护由为重要，更多数据统计中，细胞系使用特点，原代注意事项都可深入讨论。
接种后分析：不成瘤，炎症、空洞、先成瘤后消失
痛点长期验证统计后，PDX临床应用中成瘤不易给出些参考建议，人源化模型通过细胞质量提升提高人源化比例等更多技术储备。
要能详细讨论，我们从细胞接种前状态，给些参考建议，与预判结果-接种前描述细胞处理非常重要。需要试用优化胰酶用户，可来信申请免费试用。
动物模型深入讨论的用户，我发您些相关需要统计的内容，看后给出参考建议-涉及面较广，我们提到的建议都可发免费试用验证。
验证后我们给出些理想结果，通过统计，给接种成瘤困难的细胞系拿到些数据，并优化理想的实验条件，一瓶25培养瓶或75培养瓶接种一只动物，
上述优势，建议预实验先行验证后，验证可行后，后面几点延展应用
成瘤：高质量细胞，建议共同完成少量细胞量接种动物稳平验证，大大减少细胞培养相关试剂，耗材，人力成本。（告知成瘤需细胞接种量用户，我们可配套换算出节省成本，人工等）
类器官建系思路、普通培养基+血清，简单易行，成本可控，简单易行可重复充足细胞量，在进行减血清方案，无血清方案，每个实验室根据自己资金情况，每个实验室都熟悉的操作步骤，都能简单重复实验，（自动化培养-微流芯片控制培养-冗余试剂开发）

长期痛点讨论验证：
看完协和库类器官，芯片相关报道，类器官细胞建系还是痛点，PDX历程也是建系为痛点，顺序性展望资历浅不敢为妄谈，通过细胞系成瘤不稳定接种细胞做些反向相关统计，北京地区实验室，技术型公司可深入讨论。
科研\生产用户：该套试剂应用，慢病毒、腺病毒、蛋白需滴度高的用户，我司冗余试剂优势可详尽介绍配套自动化试剂与技术部份，厂家建议可痛点先行验证,。科研用户需求的用户，我们可找厂家对接就近设备预实验。自动化培养设备厂家这部份技术储备相对少。上述任何资料又兴趣老师，可留邮箱，发您适合国内细胞培养体系痛点案例细工方案（黑点、生长慢，不成瘤介绍）

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阿尔兹海默症常用案例细胞-细工生物
一、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞系
二、人神经母细胞瘤细胞BE（2）-M17细胞系
三、NG108-15细胞系
四、Neuro-2a细胞系
五、BV-2细胞系
六、HT22细胞系

特点描述
团块（成团成片，堆叠的等）特性常，推荐细工优化胰酶-细胞膜无损，目的就是把团块消化成单个，靠吹打损伤大，后面有条件可以是试试，转染前，冻存前消化成单个大大提升转染效率，与复苏后活率，要有时间比较，大家一起讨论。这类团块特性冻存条件有些特别处，建议与10%DMSO做个比较，另冻存建议后的海绵盒加棉花包裹，一分钟降0.4-06度，建议这个有时间也做比较。
另上清液收一部分保留，长期保存在负80，后面复苏后一代传代后加有奇效（生长瞬间长满）BV2有这个特效，上清其他用图，转染后死细胞过多救助。理由是，类器官传代需汇50%，才能继续培养，全新完全培养基换后全死（参考赛默飞类器官培养）其他上清回输细胞有需要资料的可回信，我统计的难养的，乳腺，前列腺，腺类，胶质类。

细胞应用细工预实验参考-上清回输利用
预实验上清回输要能拿到理想结果，对成球解决也有很大帮助，成团成片，堆叠统计了很多年，各类细胞的。免疫类最早开始统计，这个解决是直接加液分瓶，不弃液，临床培养直接补液，后期收获时，就没有团聚了，参考
关于上清回输思考：国内建系目的，经一系列难养细胞问题统计，上清回输救助细胞有明显效果，国内感兴趣组可一起讨论。
几项长期统计与上清回输有关联的有，
1：难养系大部分需要上清救助，案例较多，腺类、胶质类、神经类、乳腺类、前列腺类系、胰岛胰腺类、免疫类，上皮、成团成片特性，堆叠特性
2：细胞系类我们在解决团聚后，转染效率可明显提升，HEPG2,HEP3B、腺类神经类并存系类
3：冻存复苏胰酶法解决团聚后，复苏活率可也提升，这类冻存我们推荐传统方法，DMSO+程序降温能有更高细胞活率要求、临床样本研究组
4：类器官传代需50%上清回输。
5：外泌体研究，上清产物
6： 极体(polar body)-胚胎发育、
7：Matrigel组成，从富含胞外基质蛋白的 EHS 小鼠肿瘤中提取的，有研发生产用户可讨论细工优势。
经上述统计总结，这类细胞属于营养缺乏是其中一种情况，案例细胞是临床培养免疫细胞方法，不弃液培养，后期收获细胞团聚可打开。雪旺类只生长细胞膜，细胞壁增长，该项还没有深入问题统计，癫痫病机制研究，阿尔茨海默病和帕金森病，突触传递调控，可塑性细胞培养用户可深入讨论。


生长慢
细胞系：
1：种子库级别试剂-统一标准后，痛点问题可找到准确点，后期会推出自动化培养-冗余试剂配套精准SOP
2:   细胞瓶培养,控制完全培养基PH变化更可行，皿类二氧化碳代谢较快，PH变化太大，三天以上增殖瓶优势明显，很多高手忽略项关键因素，细工救助案例多，具体细胞具体分析细节。
3：细工优化胰酶优势，细胞膜无损，预实验建议胰酶敏感细胞长期验证，我们是对种子库级别要求长期验证后评测。
4：原代，离体后处理组织块，化学力，机械力影响，建系是我司统计目的，血液类建议直接培养，目的细胞获得，可参考我司简易单克隆法，结合促贴壁试剂，拿到目的细胞。

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PDX 类器官 首代难养-长期统计相关前期分散与后期统一汇总目的

钙与巨噬-无钙，血清，培养基，开发中，相关实验数据统计。钙化关系
血管钙化、肺钙化、动脉钙化、乳腺钙化、甲状腺钙化、、前列腺钙化、心脏瓣膜钙化、海默
血液中巨噬，尿液中巨噬，辅助-临床研究数据统计
滋养层辅助建系，简易单克隆反复优化克隆、持续炎症环境-建系技术储备
耐药株方法步骤辅助，简易的单克隆辅助筛选，细胞膜损伤避免优势，冻存复苏优化关键关过。
首代简易培养推荐理由，每个实验室技术储备充足，先得大量细胞，在上减血清方案，无血清方案。
想不通，通过细胞系成瘤失败案例，先做反向统计。

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慢培养操作习惯及相关应用参考-耐药-建系-晶体
我司思路，最简单验证方法是，痛点难度大细胞我们试剂方法可全到，验证顺利，在谈合作。
建议给个新手验证，新手验证要等顺利，说明我们方案，推荐方法可行性，包括无解，无文献培养中问题。
可验证细胞系：黑点，生长慢，不成瘤，简易单克隆，超量培养。原代。
细工成熟推荐蛋白纯化前，细胞规模培养-预实验到中式，后期蛋白纯化，蛋白保护剂研发，结晶关键点问题统计中。

海归组参考一个整体完整参考思路,

耐药株建立，晶体设计，突变筛查，也可分几个部份分别发文章，一种癌种成功后，可做其他类癌种
实验过程中想到几个要点细工优势，简易单克隆，后细胞超量培养，也可反复单克隆优化，现有细胞系大部分也是同样同理方法，经过多次冻存复苏（细工又较好方法步骤推荐，也是耐药株建立的关键步骤）稳定细胞生长（慢培养操作也是建系关键因素），细胞质量，数量，超长维持培养，都是结晶关键所在，预实验也可用熟悉细胞做，跑通整体有个清晰步骤，培养体系评价，细工给出参考建议，评价大牌厂家试剂培养特点熟悉，案例较多，重点室深入合作统计习惯对每类细节处有较深入讨论，与相关案例验证可行性。例如成瘤不稳定组，慢操作验证及简单，并能优化出更有方案，操作工作量还小很多，也是我司一致推荐尽可能用到最好培养体系，人工，费时，试剂费等用总体看，还是节省出很多，冗余条件充足，也是我司开发试剂最重要的条件。
蛋白结晶：细胞维持培养，超长维持培养，对蛋白高产，灌流反复收获细节，让蛋白纯度大于60%（工业相关生产蛋白案例，我司都是几十倍或者百倍，细胞都较常规，耐药株相关案例还较少，目前新手一遍过耐药株能到2-3倍，还没做到冻存复苏，单克隆等后续），尽可能高是结晶关键。
293病毒感染细胞案例七天，噬斑记录十四天。
关于结晶，细工优势到细胞培养大量生产这个步技术储备充足，蛋白纯化，分子筛，结晶前蛋白处理路过厂家有研发合作兴趣可标注下，课题组有兴趣合作结晶前蛋白处理这部份都可深入讨论，我们可对接重点室合作，共同申报，药厂合作。
如有兴趣，缺养条件更长维持培养相关科研合作，西藏，云南，青海等高海拔实验室也在合作研发中，建系，生产，特殊培养需求等应用目的。
如需结晶试用设备，或者晶体委托我们都可找厂家或实验室合作，如能谈到这步，人才培养毕业后工作也很稀缺岗位。（包括自动化培养验证，微重力蛋白质晶体开发阶段）
我司方向是建系，含血清，细胞工厂为主，无血清应用请注明，这个相关技术与试剂开发验证周期更长，对待痛点问题，理论上是相同的。
细胞系耐药株，晶体研究顺利，可深入在可上原代重复。

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微重力蛋白质晶体开发阶段

细胞粘附：各种常规粘附剂与细工产品差别。优势讨论，细工促贴壁工业案例多，案例细胞成熟。技术储备足。
粘着斑
微重力会改变各种细胞类型的基因表达模式
肌动蛋白细胞骨架和微管网络协调（Okumura等人，2006）
微重力条件下，细胞的机械卸载改变了生理学和病理生理学之间的平衡，加速了某些疾病状态的进展和发展
通过硬化蛋白途径增加骨量的合成代谢剂（Scheiber等人，2019 年）
巨噬-炎症，软骨细胞-骨关节研究，炎症与微重力与传统研究种变化差别
微重力诱导的免疫细胞和癌细胞的细胞骨架调节-通用培养基
在微重力条件下石头的形成速度会加速（Pavlakou et al.， 2018）
微重力环境后发生的最明显的细胞变化是细胞形状、大小、体积和粘附特性的改变（Buken等人，2019 年;Dietz等人，2019 年;Thiel et al.， 2019b）
骨质疏松症可能需要几十年才能发展，但这种疾病可以在较短的时间尺度上在微重力下建模（Pajevic 等人，2013 年）
可作为合成代谢剂 通过硬化蛋白途径增加骨量的合成代谢剂（Scheiber等人，2019 年）
其中机械卸载增加硬化蛋白表达以促进骨吸收并导致骨密度损失（Robling et al.， 2008）
模拟微重力环境中长期培养甲状腺细胞（Kopp等人，2015 年;Krüger等人，2019a）
蛋白多糖水平降低与 ECM 相关基因和蛋白质的增强调节相结合，有助于防止骨关节炎变化，包括 I、II 和 X 型胶原蛋白、β1整合素、波形蛋白和硫酸软骨细胞