细胞培养-成团成片统计交流

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目前统计问题成团成片常见细胞：后续解决方案稍后总结好后发您共享，希望各位老师参与我们统计活动。
比较常见细胞：
绒癌细胞JAR  结肠癌LOVO细  293细胞  肝星状细胞  原代神经神经干细胞  A7R5平滑肌细胞  MCF7细胞 PC12 PK15和ST  成骨细胞  NRK细胞,calu-3，T-47D  HCT-8 胰腺癌BXPC-3 成纤维细胞  sw480 Vero HepG2 海马神经元原代培养细胞、成团生长的癌细胞如何消化成单细胞上流式   SH-SY5Y细胞 HCT－116  C2C12肺癌的原代 原代乳腺癌细胞 原代乳鼠大脑皮层神经细胞  白血病细胞系UKE1  u87细胞生长成团  SK-OV-3细胞 4T1细胞离心后细胞成团怎么办  HepG2.2.15细胞成团生长 YAC-1成团现象严重！！ HL-60细胞培养的成团现象?  LS 174T 细胞一直聚团，不容易消化 大鼠肺成纤维细胞 PC9细胞 HCT细胞 MSC

统计建议方案：
一：低浓度胰酶稍长时间消化，贴壁与悬浮可回信
二：胰酶前一步，etda直接消化。
三：DNAsa裂解。

后两种方法有效果的老师，建议留下详细操作步骤。
试剂引起的细胞状态老化，请区别下。还有较好的血清也会引起细胞成团（有些血液类）要与试剂引起的老化要区分。上述建议沟通前，列出细胞来源，详细培养方法。细胞状态描述。

有更好方法的老师可回信告知，说的不对处，请老师指正。国内正规库细胞查询可留言，我们这方面资料很多。长期统计也是难养的细胞系类，乳腺癌类，肝癌类，血液类悬浮细胞，我们有几年的统计及建议方法。

ss359

谢谢分享，收藏了

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这是我们细胞方面的应用，希望与各位老师学习交流。
禽腺病毒全病毒及基因工程疫苗技术
1、目前，绝大部分疫苗厂家都已采用 LMH 细胞生产禽腺病毒疫苗，但由于 LMH 细胞的 易聚团、难贴壁等特性，因此，在疫苗产业化过程中大规模培养 LMH 细胞有一定困难， 而且病毒滴度低，基本都在 107.0/0.1ml 左右，极大地限制了产能。本公司经过多年研究 建立了一种新型 LMH 细胞的培养方法，利用特殊的集全新细胞贴壁与病毒增殖于一体的 独特技术，使 LMH 细胞贴壁时间大为缩短，而且细胞培养 192h 后仍保持较好细胞形态， 易于禽腺病毒病毒的复制与增殖及后续毒价测定。4 型禽腺病毒病毒 TCID50 效价大于 108.5/0.1ml，目前 1ml 全病毒培养液可配制 200 羽份疫苗，可 100%保护 SPF 鸡免受 4 型禽腺病毒强毒的攻击（未免疫组攻毒 72h 后 100%死亡）。该试验结果由不同厂家不同 专业人员多次在细胞工厂上验证完成。
猪腹泻病毒我们正在做，愿各位老师交流技术细节。

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国内库难养细胞系：beas-2b  HK-2  INS-1 THLE-3
问题特点
贴壁不牢，易成团。导致就是生长起来后，大的细胞团块冻存，成冰球后，导致细胞复苏后，状态不佳。成活率低特点。
解决方案
Optimized Trypsin：优化胰酶
细胞增强贴壁试剂：与消化结合，使细胞成单个，解决团聚问题

又做这类细胞细老师可来信讨论细节

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Optimized Trypsin    给细胞工厂开发，容错率高，易重复，对细胞损伤更小，建议较难养细胞ATCC来源正常类细胞都有细胞消化成单个细胞后传代。这一指标我们觉得很重要，并我们的这个胰酶可以完成这个要求。2020案例细胞用户：胰岛胰腺类细胞及INS-1用户评价极高。

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细胞增强贴壁试剂-比同类产品比较，性能及易操作上优势很大，案例细胞293培养上很明显（细胞不脱落，质量无衰减，常规胰酶消化推荐0.05用时40分钟左右，工程用案例细胞已传上百代），救助细胞首选。
共聚焦实验中应用优势有，细胞伸展度好，细胞组成器件图片清晰。

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原代上皮建系困难，有几株建系成功培养过程中也不是很容易，特性都是容易团聚后，贴壁不牢，下面促贴壁试剂是我司给这类特性细胞开发的解决这问题的试剂，经几年统计跟踪，得到较好的效果。产品链接里有说明该试剂与传统方法与试剂明显优势，黏连蛋白，明胶，多聚赖氨酸类区别。
促贴壁试剂比上述产品应用优势很大

原代上皮建系难度较大，对相关研究及药物开发多年困扰着科研进展，常见细胞系
人肾皮质近曲小管上皮细胞；HK-2
人乳腺上皮细胞；MCF-10A
人肺正常上皮细胞BEAS-2B
人肝癌细胞；Hep G2 [HepG2] 上皮样
人胚肾细胞；293 [HEK-293] 上皮样
人脑星形胶质母细胞瘤；U-87 MG [U87MG；U87 MG] 上皮样
其他来源组织还好，例如人前列腺上皮细胞；RWPE-1只要是血清替代品培养，就会较顺利，换血清后反而不理想，也说明这株是无血清很成功一例（该株较特殊，有了解或做相关研究老师可告知一二）。

选择含血清方案理由及建系成功后细胞工厂大规模培养

无血清方案国外几个大厂家的方案还不是很成熟，例如工程类培养过程中，也是各类补料常年更新，种类较多，也说明该技术不是很成熟，就现状因素，我们选择含血清方案值得推广，成本相对较低（后面培养过程中也要大量培养细胞，建系相对容易），细胞培养多年来应用案例也成熟，得到预期结果相对较稳定可行方案值得推广，在无血清中大厂家案例中，无血清方案不顺利解决办法还是少量填加血清会有较好解决办法，例如:THLE-3,beas-2B等多种无血清方案培养过程中不顺利，加少量血清后救助成功案例，我们平时统计过程中这种案例也很多，不一一列举了。

因子相关上清利用推荐理由：我司在解决难养类细胞统计过程中，很多株难养细胞，都有回输上清后，比全新完全培养基增值效果更好，原代由为突出，目前能理解到，就是原代上清利用，使细胞尽量模拟体内环境，分泌相关的因子，目前国内有几个实验室在搞上清相关分析，也是刚刚起步解决，国外相对成熟很多了，有兴趣老师可回复邮件标注下。相关进展可推送给您。

规模培养细胞工厂推荐
上皮细胞建系及规模培养，含血清方案贴壁培养更适合该类细胞大规模培养，上述无血清是一个理由（无血清较大厂家也有过原代靠前几代适合，代数较多后分化较快），还有根据细胞特性，上皮类建系困难，也是影响相关研究及生物类药重要因素，含血清及细胞工厂应用，对建系及大规模培养相对容易很多。国外较大厂家也对细胞工厂改进新品，最近才推出，也说明相关问题。


另:常年相关研究课题组，可注明，我们对试剂耗材保钟级别要求可讨论，或者后面遇到正规库来源培养不顺利问题（公司来源暂时不参与），可详细描述问题及处理步骤，我们又把握寄试剂解决，在解决问题过程中，顺便讨论保种试剂理由，采购血清前相关细胞评测（raw264.7\THP-1等较难养细胞评测），下面链接是关键点做了些总结，具体问题具体分析。

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原代建系培养可讨论关键点：离体后消化，促锚着处理，密度抑制（如何避免有限代次），转染（试剂方法经验），病毒感染，单克隆，耐药筛选等。

补充内容 (2023-7-25 16:09):
原代巨噬超量培养可讨论，细胞系上应用已经很成熟了

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国内正规库成纤维培养一些介绍。

国内库可用成纤维列出参考，如有其他株来源，ATCC，DMSZ，正规来源，培养条件自律要求高的实验室。培养中问题可讨论。

3T3 swiss

3T3L1

3T6swiss

BALB/C 3T3

CCC-ESF-1

CCC-HPF-1

HFSF

MEF

MRC-5

NBTF

NIH3T3

OP9

PA12

PA317

Pt67

RCBBF

RCFBF

RYTF

UMNSAH/DF1

WI-38

WI38/VA13

φ2





3T3细胞的几种分类

是G．J．Todaro等从Swiss系小鼠胎儿里得到的细胞株。由于它显示出强烈的接触抑制作用，所以能明确地识别已发生转化的细胞，并作为一种重要的细胞材料使用于由肿瘤病毒和致癌剂等所引起的体外致癌研究。这一细胞系是将3×105细胞接种在底部直径为5厘米的培养皿上，是根据每三天进行一次连续培养的方法而建立的。3T3这一名称便由此而得。同样，由6×105细胞或12×105细胞进行接种而得的细胞株，分别称为3T6和3T12，这些细胞的接触抑制作用很弱。此外，在与3T3同一类的细胞中，有来自Balb/C系小鼠的Balb 3T3细胞。

NIH/3T3 细胞

细胞种类：小鼠成纤维细胞；细胞来源：swiss小鼠胚胎；培养基种类：DMEM+10%小牛血清；细胞状态与特征简述：NIH/3T3 细胞对肉瘤病毒灶性形成及白血病病毒繁殖高度敏感，常用来做DNA转染的受体细胞。细胞融合80%或更少时传代，每周至少2次，决不能使其融合率更高。细胞贴壁生长。

3T3一L1

成纤维细胞3T3一L1是来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株，是国际上公认的研究脂肪细胞分化的细胞模型

swiss-3T3

包括所有的swiss小鼠胚胎的成纤维细胞系



3T3-L1 细胞连接-------------------------------------------------重点

https://www.atcc.org/products/all/CL-173.aspx

L1 is a continuous substrain of 3T3 (Swiss albino) developed through clonal isolation.

L1是通过克隆分离培养的3T3（瑞士白化病）的连续亚株。 胰岛素，表达  甘油三酯

The cells undergo a pre-adipose to adipose like conversion as they progress from a rapidly dividing to a confluent and contact inhibited state. A high serum content in the medium enhances fat accumulation [PubMed ID: 4426090].

当细胞从快速分裂到汇合和接触抑制状态时，细胞经历脂肪样转化前脂肪。培养基中的高血清含量可提高脂肪积累[PubMed ID：4426090 ]

Protocol:  Never allow culture to become completely confluent. 1. Remove and discard culture medium.

2.Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin - 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum that contains trypsin inhibitor.

3.Add 2.0 to 3.0 mL of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).

Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37C to facilitate dispersal.

注意：为了避免结块，不要在击打或摇晃瓶子时搅拌细胞，等待细胞分离。难以分离的细胞可以放置在37℃以便于扩散。

4.Add 6.0 to 8.0 ml of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.

5.Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.

The recommended inoculum is 2 to 3 X 103 cells/cm2. Subculture before cultures become 70 to 80% confluent or when cells reach 5 to 6 X10(4) viable cells/cm2. Corning? T-75 flasks (catalog #431464) are recommended for subculturing this product.

6. Incubate cultures at 37°C.



几个常见问题：

二倍体对完全培养基PH要求严格，大厂家及现配现用是个不错的方法。

密度抑制解决：不要长太满，勤传代，生长天数较长的先摸出适应的培养条件，进口耗材，瓶推荐（皿PH变化快）耗材U型低是这类细胞研究很早推出的，目前类器官应用较多。-种子及前期大量扩增需求。

分化后培养状态探讨，这种状态下的细胞增殖较慢（大多数细胞有成纤维型生长成圆形），结合目前培养耗材更新（耗材底部营养可交换，成层生长可以试下，也是类器官方面耗材主流）理论上可行，国内正规库在维持培养上已经有十几年的经验，细胞一年内维持培养还比较容易实现，也是密度限制一种可行性验证。

用胶原、赖氨酸等处理下板子，增加贴壁能力的目的实验，可参考我司促贴壁试剂，效果更优，最近实验验证是RAW264.7细胞促贴壁验证，增殖过程中细胞形态无变化，也说明促贴壁试剂对细胞无影响。

胰酶消化：我司优化后胰酶优势，不怕消化过，充分利用胰酶化学作用使细胞成单个状态，传代后的细胞，不需细胞膜恢复，直接增殖生长。

3T3一L1传代需小牛血清理由：当细胞从快速分裂到汇合和接触抑制状态时，细胞经历脂肪样转化前脂肪。培养基中的高血清含量可提高脂肪积累[PubMed ID：4426090 ]

Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37C to facilitate dispersal.

Volumes used in this protocol are for 75 cm2 flask; proportionally reduce or increase amount of dissociation medium for culture vessels of other sizes. Corning? T-75 flasks (catalog #430641) are recommended for subculturing this product.--该耗材国内应用较少，前期种子阶段培养推荐康宁-3799-96孔U型低耗材替代。

二甲基亚砜敏感，解冻后应立即去除冷冻保护剂，在9-10毫升完整的完全培养基溶液中进行缓慢离心（125×g，10分钟）



延展应用：例如类器官主流耗材U型培养底，在成纤维类细胞应用应该是最早来源，还有我司推出的维持培养基，

上述要点对后面有类器官，外囊泡，需大量扩增细胞要求的实验需求的用户，需细胞数量与质量提升做好基础培养可深入讨论，讨论前需详细告知试剂耗材及操作步骤，实验目的需求或细胞具体要求。



细工总结推荐：

1，保证细胞状态良好，因此培养液营养要充分，要不勤换液要不一次多加些培养液。

2，可以用胶原、赖氨酸等处理下板子，增加贴壁能力,细工增强贴壁更适合。

3，吸液的时候不要全吸干，如果定量必须吸干，先平着吸之后再竖起了吸，尽快第一时间补加培养液，刚开始补加时倾斜板子、速度不要太快，加到一定量时要时不时的把板子平一下，保证培养液覆盖整个有细胞的孔底，以此避免细胞干涸脱水死亡。

细工建议：防止漂可换成减血清或维持培养基，限制细胞增殖，有必要可加促贴壁，适合滋养层目的实验

1：上清利用。

2：优化的胰酶消化，或者就用EDTA加震荡也可试试有无好的趋势。

3：U型低应该更适合细胞增殖，没有相关条件，可让细胞聚集些，可能会好些，可还是没有U型低条件好。我觉得很重要这点，也和困困老师深入讨论过U型低理由。好几年了，也没有机会试试。最简单方式用U型96孔版，这个很多，验证也很容易。

4：其余就是您组养原代细胞系经验了。

5:这类细胞系要能超量培养，类器官，外囊泡相关研究都很热，而且不存在难点。

6：我们优化胰酶用上效果会更好，细胞膜无损，消化后直接生长，没有细胞膜恢复这个步骤。0.25胰酶会有这步，验证细胞就是293，平时统计后，一直解释不清楚为啥我们一脉消化很长时间后，细胞能生长更好。还有HUVEC协和建系那株，消化两小时后，细胞增殖没有影响。这是新总结的。

7：促贴壁试剂关于细胞影响，我们后面准备用RAW264.7试试，这个细胞设计可解决老师对细胞影响的疑虑，这个细胞国产耗材、试剂都能养出差别（长角），内毒素或其他影响因素都会使细胞变形长角。我们促贴壁不会，药物所正在做相关，就是个新手，要是个老手验证就更好了。

补充内容 (2023-7-25 16:01):
胶质类神经细胞BV2统计结果是，上清回输培养，增殖效果明显，不知二倍体应用是否可行。有兴趣用户可告知试验目的，操作方法可讨论。正常细胞线粒体要大很多，暂时判断是线粒体作用，有其他统计数据后再讨论。

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维持培养相关-目前研究中类器官，外泌体这个培养基开发是个不错的思路。

使用半乳糖作碳源D+ Galactose（常用培养基都是Glucose，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时) 该成份是我司在开发维持培养基中一种成份，后续根据实验或生产目的不同，其他成分组加减案例已有溶瘤，抗原抗体生产用户应用，要是能较深度理解该成分目的，后续其他实验生产中作为解决难题痛点至关重要。各组织部位来源不同，培养中要点与特点也是有些差别，不管哪种应用，细胞质量更好些，对后续试验相当重要，转染效率，冻存复苏这些比较后试验能看到差别，为后续实验目的达到理想效果做些有益的推进，我们在腺病毒工业应用中也是得到用户满意的肯定。
二倍体细胞较重点也是维持PH值得稳定。很多细胞也是这个这个问题保种及相关研究进展缓慢，原代培养与建系等，大型疫苗生产或者这类有应用前期预实验非常简单，也是发多数细胞上游开发者认可的理念，也都作为核心技术部分很少公开相关。

该类培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。

综上该类培养基用于原代培养一个不错的方案。
国内有考虑用这种培养基建系实验室相关问题可讨论，简单参数阐述相关参考比较
常用于Mammary gland cell培养基中D+ Galactose   Concentration (mg/L)  900.0  mM  5.0

常用DMEMD -Glucose (Dextrose)Concentration (mg/L)    4500.0    mM  25.0
常用RPMI 1640-Glucose (Dextrose)    Concentration (mg/L) 2000.0   mM 11.111111
常用MEM-Glucose (Dextrose) Concentration (mg/L) 1000.0   mM  5.5555553
便于记忆了解，从糖成分看培养基发展史，成倍关系。


相关研发培养目的文献中思路参考文献：
1. Chinchar, G.D. and Sinclair, J.H. (1978) J. Cell. Physiol. 96:333 (amphibian, frog, ICR, 2A).
2. Leibovitz, A. (1963) Am. J. Hygiene 78:173.
3. Middlebrooks, B.L., Mak, P.C. and Ellender, R.D. (1980) Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 165:123 (fish fibroblast).
--列出都是较早文献目的是开发人员碰到相关难题更深入了解发明者的思路，发明想法，开拓解决思路，细工在统计问题解决问题过程中受益匪浅。相关介绍我们又对细胞系中难养细胞有一整套思路，后面碰到该类问题，都可告知讨论，我们给出参考建议。例如无血清开发，国内老师缺少含血清培养历程很多相关资料。


该类细胞系应用J较多的是L-15培养的乳腺类较多（文献案例值得参考，国内正规库都有很成熟与1640替换经验与案例细胞株，科研用户的驯化还不是很成熟，细胞容易中途挂了），有些相关问题统计与解决思路。欢迎深入交流讨论。

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题目延展应用
成团成片特性细胞大多数上皮（有半悬半贴壁特性，正常组织细胞系都有这类特性，常规手法冻存复苏后活率低，恢复生长时间长）
免疫悬浮类离体后前几代培养，或这类特性细胞系类前期传代培养中。
无血清培养基应用的细胞-工业应用的解决团聚成份已有成熟应用，无血清开发也是用化学成份替代胎牛找到更合适的成份与比例。不含血清培养上清利用替代血清成份已有几个大公司在应用。无血清上清成份分析课题也有不少实验室在延展实验。

我们平时统计相关问题，在团聚与解离细胞培养驯化技术储备应用有些方法，目的是在提高转染效率，冻存复苏提高细胞活率，复苏后救助细胞。精准控制团聚与解离还有待更多实验数据（细胞反向驯化也有些方法储备），在融合细胞过程中，利用团聚与解离特点可试试能否提高融合效率，有这方面有想法的用户，可讨论具体。列出细胞名称，培养特点，问题描述，目的需求。融合后杂交瘤优化培养基培养方案已有（也适合二倍体类培养基减血清方案）WI-38 MRC5这类可标注。

补充内容 (2023-7-25 15:54):
成团成片解决案例：HEPG2细胞典型的团聚力度大于贴壁力度，该特点注意后，加促锚着辅助，大大提升转染效率到50% 也可肯定应用复苏冻存上状态明显提升很多，前沿类器官，人造肉大量培养上也是前期目前可行性较稳妥

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统计开始：耐药株，稳转株要点
易团聚，成片特点的细胞也是耐药，稳转株在后续实验中关键（大部分不顺利细工意见是这类问题影响的），细工优化过的胰酶是解决这个问题较准确解决问题的试剂，可结合后面保种方法验证，复苏后状态更能说明问题），上述两类细胞实验细节可讨论沟通，应该能稳妥可行备份方案，难点可沟通，各类细胞特点不一，标准很难统一。
要点：千心万苦做好的成果细胞株，保种尤为重要（统计有段时间了，很多实验室做出来相对容易些，就是保种后，复苏活率太低（细工有相关救助试剂，可申请试用）分析是，做出这类细胞后，也到课题结题毕业阶段，大部分应该是这个阶段，种子库保种理念国内正规库经验足，购买细胞时，建议沟通整体保种理念，观念。海归老师的问题最有价值，他们描述的问题，大部分是国外前沿与国内试剂水平的整体差距），细工先以冻存这个小小的问题，说下自己的经验介绍，冻存遵循传统DMSO方案，并建议在优化-各个细节问题都可讨论沟通，准备实施的实验室，可在熟悉的，好养的细胞上验证结果后再上目的细胞，保种种子库试剂概念试剂评价，技术验证可长期讨论，就难点问题，后续可小范围专业人群讨论(暂时先在北京地区），大牛老师您点名，我们去请。目的结果必须呈现精彩。热点问题，国产备份试剂讨论，大质粒转染，难转细胞，大体积规模转染-都是基于试剂方案。目的蛋白保护剂开发评价讨论（就蛋白保护成果转化目的方向类建议全部用到（GMP级别）。

小金库

谢谢分享。

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应重点室要求，做国产体系与进口体系平行验证。

进口ATCC+293FT
细胞
1：常规培养
2：包装慢病毒，腺病毒常规滴度，十倍，五十倍，100倍可行方案比较。
3：无血清相关数据测定

通过该实验，与各位老用户够共享细胞，培养方法细节详细要点步骤。
生产型可做国产厂家备份，特别要求可提前讨论沟通。
目的：国产培养基体系备份、相关蛋白高产、无血清培养基开发、感染原代建系方法用高滴度蛋白可行性评价。
培养中问题都可讨论。较前沿话题，磁与细胞培养，国内体系脂质体开发可行性（我们在难转细胞统计上下功夫，有些思路待验证。细胞拉力检测通路检测等。高滴度蛋白感染原代建系应用理由，常规滴度感染一两个细胞，相应高滴度感染效率也成倍增长，建系可行性更高。浓缩虽然是较广泛应用（该方法与生产高滴度不是一个数量级）
对上清应用较多的用户，可讨论各个厂家在上清生产后效价，等关键参数（内部资料，销售参考资料，不做宣传用途）参考资料

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类器官相关
0230912:细工经统计与自身对细胞系技术储备结合，明确我司类细胞（类器官）先建系，明确细胞身份后，建系后再成球或其他相关实验，对药物评价方面研究也可先二维常规培养验证预期（优势各实验室都很熟悉，相对容易很多）有明显预期结果后，在做成球方面深入研究。肿瘤与正常细胞可同时进行。
就上述方向细工优势：建系用慢病毒腺病毒相关蛋白高产几年来是我们重点开发的方向，企业工业用户相关应用也很满意。
相关可讨论：种子来源（评价及推荐，各厂家优略参考意见），试剂保种体系国产备份，技术细节统计及储备。耗材推荐参考。细节处反复强调，最终目的是建系成功。可重复性高。
离体后处理问题讨论（各组织来源不同，我们结合难养系常见问题参考补充）。
培养体系优化，建系需大量试剂，对成本要求高，协和细胞库培养经验与可行性我们认可并学习。经难养系多厂家反复互换培养，得出参考意见是，用更高体系完全兼容普通培养体系（一定要大厂家，成分可查，厂家研发提供较详细资料，我司总结的正常肝细胞系非常有参考案例（thle-3对ATCC官网公开部分常年统计，对现状类器官培养基我司片面意见是，成分太多了，简单阐述是，原代，腺，神经类各种营养因子都有，培养后目的细胞不明确，肿瘤，正常，巨噬等，后面用途可能会更模糊（个人意见，说的不对处，老师谅解并提携指正）
干细胞球消化对不加载体类细胞直接成球很有参考意义，干细胞相关研究国内有很多大牛实验室一直在做。经验很丰富。
微载体方法建议用下我们促贴壁试剂比较，球传球，优势明显。
关于直接成球方法，我司正准备上胚胎培养基试试，球增殖较难，居于文献面太窄了，有上相关实验后的细节问题都可讨论。胚胎培养大牛实验室要路过，给发个联系方式，后面有问题需咨询。
合作实验室已经应用好几年了，这两年类器官公司相关出来很多，有点懵，静下心来，明确我司方向，建系后成球相关为主。长久方向。欢迎技术参与留言。
总结要点关键： 离体消化统计并优、建系后成球培养体系优化、建系体系试剂试剂委托生产、难点痛点统计

补充内容 (2023-10-8 17:32):
20231006: 国内珍贵细胞系救助，单克隆后保种，从耗材，试剂，手法等内容详细讨论保种要点。

国内自建系优化保种：近年有些实验室有自己建系，了解大概情况是建系后传代天数较长，提高生长速度也是很关键指标（...

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国内自建系优化保种：近年有些实验室有自己建系，了解大概情况是建系后传代天数较长，提高生长速度也是很关键指标（来自常用系常规特点，一般好养的系长满传代也就一两天，难养的三四天就算很长了） 如果没有达到这个指标，国内建系很难保证后续相关实验，优化试剂，耗材，手法，例如冻存建议还是用传统DMSO方案比较稳妥（ 该方案相关问题都有很长时间的技术储备与解决问题经验,案例细胞复苏率很高，接近100%，PBMC,优化细节可讨论）较新的无血清冻存液应用，暂时统计数据也只是无血清培养体系还比较适合，更多相关统计都可讨论问题细节。干细胞相关数据还很少，上述只做细胞系类参考。细胞系类问题经验统计来自国内正规库学习与平时销售问题总结统计（保种体系观点是细胞系可长期使用，需该观点可长期就前言问题讨论保种优化）

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建系技术内容讨论： 建议技术部分全部共共享，难点问题涉及上下操作与解决思路非常关键，就难养难建系肝，乳腺我司目前解决思路可深入讨论，建系用高低渡病毒我们提供上游全面技术资料，可委托生产或合作生产，建议有GMP生产资质的合作，产品较稳定，我们可提供大面积用户测试评价。目前了解到的情况还无相关高低渡厂家（国内国外） 只为建系目的，其他应用可在讨论。

补充内容 (2023-12-5 04:41):
黑点、生长慢，类器官痛点-（黑点结合我们广谱杀菌比较完整解决）

关于黑点，生长慢，细工建议参考，用对试剂耗材（种子库级别细胞不建议用便宜试剂，保种上百只种子细胞，也用不了多少钱的）胰酶轻柔处理（避...

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黑点、生长慢，类器官痛点-（黑点结合我们广谱杀菌比较完整解决）

关于黑点，生长慢，细工建议参考，用对试剂耗材（种子库级别细胞不建议用便宜试剂，保种上百只种子细胞，也用不了多少钱的）胰酶轻柔处理（避免枪直接吹打细胞损伤也是较重要指标参数），几代或十几代后，黑点会全部消失。这个建议也只是救助办法参考建议，经历过黑点的细胞，建议重新保种国内正规库来源细胞。

   给出方案是进口瓶培养（康宁，nunc,德国产细工全部现货） ，种子库级别试剂（三千以上胎牛，我司验证五年以上南美）我司培养基或者是GIBCO培养基，放足培养基（多些也没关系）几天不动，看下恢复情况，结合我司胰酶（无损消化）传几代应该能找回较好状态，该方法也适合细胞养几代后就爬爬这种情况（上述方法也适合细胞养传代后细胞就爬爬这种情况，该因素原因很多，具体情况集体分析）该方法也建议原代首代培养（类器官）就是普通培养基加胎牛（因子贵，lag phase长、无血清不稳点）全部能替代，细胞够多或稳定后在上无血清可做参考。类器官配套耗材U型低（不加辅助条件成球）及磁珠配套磁力成球可来信告知索取资料及技术讨论。邮件联

类器官痛点
复苏还可以，传几代传到三代就完蛋，越长越少-细工复苏有很好的优化方案，后面有冻存挑剔的细胞可讨论。
状态差，每天换新，因子消耗大成本高，不见起色，可气的是养养还失踪了，-上述可行性高，且稳定，常规培养手法也熟悉。
开始还比较满意，传代也不错，传几代后，集体自杀了。--稳定的可靠的把把成很重要。

类器官成球后维持培养，细胞也会出现黑点情况，这步结合看待细胞系黑点也有参考作用，关键词：吹打，培养体系种子库级别，冻存复苏等结合看全部，是我司解决细胞系黑点，生长慢做些技术储备，顺便也给类器官做些参考。试剂耗材细胞都到种子库级别，建议养下去，给难题问题做做些技术储备。培养中问题细节可详细沟通。类器官配套耗材U型低（不加辅助条件成球）及磁珠配套磁力成球可来信告知索取资料及技术讨论。
上述黑点生长慢要能完美解决问题，建议类器官用这个方法应该更可行，血清建议热灭活后用，成功率大大提升。细胞量足够多，可换成无血清会好很多。

补充内容 (2023-12-6 14:53):
痛点应用拓展，种子库，转染后细胞状态差恢复，耐药株复苏回复，原代应用，成干应用，例如骨研究需长久培养，成瘤不理想株备份方案，细胞需长期培养，慢操作、缺氧培养、减慢分化或避免分化，分化后长期培养探索....

补充内容 (2023-12-6 14:59):
长期统计小心德，难养株与原代传代时间大部分相同，细胞系黑点与类器官长期培养黑点，都有类似特点，所以有了上述问题解决思路与配套解决思路参考，应用解决了几个案例非常理想，前辈刘树森老师学生路过能....

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免疫细胞转染细工要点参考
关键点解决细胞团聚，转然前我们推荐Optimized Trypsin优势不是一般的大，解决成团是免疫细胞关键点，用这款一没理由就是对细胞无损特点，膜无损，具体介绍可看产品介绍，通过六年以上案例统计。
关键点反转法，是目前我们统计大品牌转染得效果不错后推荐，下面有相关厂家及货号，该类产品我司辅助锚着是促贴壁试剂辅助，这个产品开发应用五年了（工业病毒生产用，293类）及免疫细胞共聚焦也可以，下面有连接说明说明。
关键点提高病毒滴度，参考下面介绍增强贴壁试剂链接，提高病毒滴度很关键，目前脑胶质溶瘤相关用户可能已到中式（订货量上判断，五年应用，这部分不讨论用户案例，技术部分可以）
关键点突破理由两点相关辅助简单介绍
冻存复苏优化，DMSO方法，提高活率细胞量与质量，目前临床合作实验室PBMC活率80%保守介绍，目标能到尽量在高些，需验证建议用贴壁试剂案例293验证比较稳妥，很多细节要沟通，能做到我们产不多参数，应用免疫细胞应该容易很多。
试剂耗材我们指定，进口耗材，及细工试剂。
巨噬培养生长分化控制，膜提取，转染方面配套该细胞目前只在理论阶段，实施还要很长时间。有涉及转染部分，在沟通讨论。
免疫类原代培养、建系、类器官等，有相关研究可来信注明，更多资料发您，邮件联系。

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医生组-细胞培养问题全方位解决讨论-细工生物
医生组-细胞培养问题全方位解决讨论-细工生物 -结合以下题目，按步骤顺利解决问题完美为首要，订购全套试剂方案用户，细工赠送国内正规库：上海库、协和库、昆明库、武汉库来源同样一只细胞。细胞库直接邮寄。并且做原代，类器官技术储备等非常容易，且有意义，理由是核心要点掌握后。

以下为邮件题目邮件讨论沟通，需要的可发我邮件，标明单位名称。
二倍体3T3,MRC5,WI38正常成纤维类几点总结讨论
国产耗材种子库讨论-细工生物
原代细胞的制备讨论-细工生物
免疫细胞转染解决思路讨论-细工生物（大牌子比较理想统计后推荐，细工研发相关试剂思路与进展统计）
胰腺癌细胞相关试剂与类器官含血清介绍参考-结合细工研发生产相关痛点产品介绍，可发试用，标注上实验室名字，公司名字。
上皮细胞培养套装（thle-3方案交流肝正常细胞系）-上皮类系难点痛点介绍，配合解决原代难点痛点参考
组织离体后首代细胞培养-结合二倍体-成纤维统计及相关讨论-皮肤组-细工生物
转染试剂开发进展的难点讨论-细工生物
免疫细胞转染解决思路讨论-细工生物
禽腺病毒全病毒及基因工程疫苗技术成品验证及含血清方案技术讨论-细工生物
细胞黑点-生长慢讨论-细工解决参考（细胞系问题相关解决思路办法，原代参考意义很大）
类细胞建系成干讨论-细工生物
胰腺癌细胞系相关试剂与介绍-细工生物  原代参考意义大
神经胶质类细胞系原代培养常见问题与解决方法与试剂介绍-细工生物
国内库成纤维系列-细工统计讨论 -细胞系难点痛点，原代参考意义大
免疫悬浮类白血病，淋巴细胞培养统计及问题沟通 -细胞系难点痛点，原代参考意义大
促贴壁细胞试剂方法讨论-贴壁悬浮反向驯化讨论
细胞培养-广谱杀菌
类细胞建系、成干讨论-肝，胰岛胰腺，细工以二位维成熟，在进行三位，磁珠加磁力架法（该方法也只是给出备份方案，包括培养基方案备份，冻存复苏优化备份为长期统计内容）
耐药株复苏讨论-细工生物
类器官痛点讨论-细工生物
转染试剂介绍讨论-大品牌评价及细工研发进展
慢病毒腺病毒高低渡实验室简单实现
国产试剂耗材保种筛选-种子库试剂耗材技术全方位问题统计与技术储备
就目前国内培养特点，问题统计与更多技术储备，国产试剂耗材常年评价，问题解决（黑点，生长慢，转染后保种，耐药后保种，难转细胞免疫类，原代类）
肝癌类细胞培养统计及问题沟通
临床专科大夫常年细胞培养一站式问题统计与技术储备