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本帖最后由 意林枫 于 2017-5-29 13:26 编辑
【导读】作者：张功臣，奥星公司副总经理，国际制药工程协会（ISPE）“水与蒸汽系统”课程专家讲师，国家标准《GB50913-2013 医药工艺用水系统设计规范》编委。 推荐阅读：微生物也能在线检测，你信吗？
药典是一个国家记载药品标准、规格的法典，是药品生产、供应、使用和监督管理部门共同遵循的法定依据，制定药品标准对加强药品质量的监督管理、保证质量、保障用药安全有效、维护人民健康起着十分重要的作用。
制药用水是制药生产过程的重要原料，参与了整个生产工艺过程，它是制药生产过程中至关重要的组成部分。制药用水的质量从药品生产质量管理规范（GMP）和药典的角度来看是非常重要的，从良好的工程管理规范（GEP）和经济的角度来看也是同样重要的，制药生产企业必须证明其所使用的制药用水系统能始终如一地提供达到质量标准的纯化水与注射用水。
微生物污染或负荷是衡量水中微生物的浓度，电导、TOC、微生物限度和内毒素是制药用水最为关键的四个质量指标，细菌的测量单位是单位体积中的菌落总数，药典规定纯化水微生物限值为100CFU/ml，注射水微生物限值为10CFU/100ml。表1列举了不同国家或地区的微生物限度药典质量要求。
目前，常规的测量方法是通过取样后于平板培养基培养计数的方法（图1），该测量方法能够检测可生长的微生物数量。传统的实验室平板计数方法需要取样、培养皿培养并等待数天，整个过程存在很多变数，包括样品制备、培养基种类、培养时间和温度，对于特殊样品，可以调节至最佳状态以加快检测速度。通过人工计数方法并换算成单位体积菌落总数。这种检测方法需要占用大量的人工，样品制备过程中容易受到污染，并且需要等待非常长的培养生长时间。部分仪器或设备具有自动取样和计数的功能，但还是需要漫长的培养时间。
图1 平板计数法
由于微生物生理和生化特征的多样性，世界上没有任何一种培养基是万能的，同时，有科学家认为，世界上150万种微生物中只有大约0.1%的微生物可以通过培养的方式获得证明。2015版《中国药典》明确指出：“在控制药品微生物质量时，可以采用非药典规定的检验方法，只要证明替代方法应用效果优于或等同于药典的方法即可”。
FDA过程分析技术（PAT）、EMA的在线放行指南、ICH Q8-10等等，都为励志于提高生产效率的企业提供机会。然而这并不让人感到意外，因为现在越来越多的企业利用连续分析技术，从而快速的检测出超标情况，并且减轻了分析人员的工作负担。“USP < 1231 > 制药用水宗旨”建议应定期监测制药用水系统，以确保该系统得到监控并持续生产出质量合格的水。”通用信息章节要求连续运行监测仪器，以便记录历史进程内的数据以供检查。连续的生产测量和趋势分析数据，也可以作为系统维护的依据。目前，制药行业已被广泛应用的在线电导与在线TOC就是该宗旨的一种表现。
2011 年，FDA 发表了“推动 FDA 的监管科学”文件，表明支持“开发灵敏、快速、高处理量的方法来检测、识别和计算微生物污染物，并且验证它们在评估产品无菌性方面的有效性。作为对上述内容和制药行业在线微生物测量仪器要求的认可，7家领先的制药公司于 2013 年成立了在线水中微生物分析仪 (OWBA) 工作组，旨在向仪器制造商提供关于新的微生物测量系统发展指南，以便该设备满足行业和监管机构的需求。
激光诱导荧光光谱（LIF）是一种高灵敏度的技术，利用这种原理来检测微生物。使用 LIF 技术的空气分析仪上市已有多年，随着技术的进步，如今可以用 LIF 技术来测量水中的微生物含量。目前，在线微生物检测仪已经成功面世，它采用的激光诱导荧光光谱（LIF）测量原理，测量样品中微生物和惰性粒子的数量（图2）。激光诱导荧光光谱是可以满足行业需求的微生物含量测量技术。所有微生物通过代谢物如核黄素、NADH 来调节他们的生长和增殖速度。这些代谢物暴露在特定波长的光时会释放出特有的荧光。
表2是平板计数法与在线自动荧光检测的微生物检测对比曲线图（数据来自梅特勒-托利多公司的7000RMS在线微生物检测仪）。在实际工作中，与安装在线TOC极为相似，水系统水样通过连接管路进入分析仪测量腔，采用405nm波长的激光，诱导微生物代谢物产生荧光，由光电倍增管检测到发出的任何荧光。水中的颗粒数量由另一个传感器通过米氏散射测定，使用先进的特定算法对来自两个检测器的数据进行处理。通过分析发出的荧光和散射光，在线微生物检测仪内置的RMS算法能够准确地区分微生物与非微生物颗粒。
检测仪的触摸屏显示生物计数中的微生物浓度（一个生物计数相当于菌落单位 (CFU)）和惰性粒子的数量。可设置用于报警、联动和规定限值的警告。7000RMS 测量0.52μm和50μm之间的颗粒，可耐受最高90℃的样品温度，为在线测定常温纯化水与高温注射用水的微生物指标提供了便利（图3）。
对于连续测量分析仪，定期校验至关重要。为了获得准确结果，可使用荧光和惰性颗粒标准物质来完成。操作时必须严格遵守标准物质的存储方法和保质期限。目前，在线连续检测微生物含量的微生物检测仪已经研发成功并投入到工业应用领域，在线微生物检测仪可以连续瞬时检测微生物浓度，无需等待。有效减少了采样人工、常规测试和材料，从而降低了测试成本，同时，在线微生物检测仪可极大的帮助制药用水系统验证部门提供准确、安全的灭菌周期，减少不必要的“过度”消毒与灭菌。
过程分析技术 (PAT) 和质量源于设计 (QBD) 倡议和制药企业认可需要通过仪器来加强纯化水与注射用水的实时监测，让生物技术公司减少对耗时的实验室平皿法检测微生物的方法依赖。实时微生物检测方法能够快速发现潜在微生物，提高制药用水质量，先进的测试方法、快速的响应速度，让制药企业更好的掌控了水系统的状态，可以让生产的产品更快的进入市场流通。快速微生物检测可及时有效地检测任何存在的微生物，并迅速采取纠正措施。
为企业减负、为社会谋福。“在线水系统微生物负荷检测设备的开发和应用将改善水系统的日常操作，降低成本并且保证水的质量”。OWBA认为制药企业可以通过在线实时微生物检测系统，从如下几个方面得到益处：
1. 通过降低实验室的工作，达到减少耗材，降低成本的目的； 2. 对微生物水平出现的问题，减少调查频率，提高响应速度； 3. 通过实时监控更好的把控生产环节和产品质量； 4. 可以即时对配料用制药用水进行放行； 5. 在确认系统运行状态过程中减少消毒周期；
在美国，常温循环注射用水系统是应用极其普遍的环保节能型设计，在我国，该设计思路还相对较为新颖，并没有被行业普遍接受。笔者认为，在线水系统微生物负荷检测设备的应用将极大的改善中国生物制药药监与企业对常温注射用水分配循环“微生物污染”的担忧。
目前，癌症已成为我国居民的第一大死亡原因，生物抗癌已成为国家战略。随着科技的发展，国内科研企业加大了抗癌药物的自主研发力度，近年来许多新的癌症治疗药物不断涌现，一些具备国际最新科技水平的抗癌新药，已经进入临床试验阶段。信达生物制药创始人董事长俞德超博士说：“如果说化学药是一辆自行车的话，那生物单抗药就相当于一架747飞机。” 经过四十多年的发展，目前生物单抗药已经让越来越多的癌症患者看到了治愈的希望。生物单抗药是目前治疗癌症最先进的药物，它不像化疗、放疗那样把癌细胞和健康细胞统统杀死，而是通过激活人体自身的免疫细胞，精准“点杀”癌细胞，它的出现使“肿瘤成为可控制可治愈的慢性病”这一人类的大胆设想成为可能。
非常欣慰的是，笔者有幸组织设计并参与了信达生物C14中试车间及1K生物抗体药规模化生产车间的制药用水系统交钥匙项目，图4是笔者于2015年在信达生物1K生物抗体药规模化生产车间成功实践的“热储存、旁路常温循环注射用水系统”项目，它属于笔者组织设计并实施的多个生物制药车间常温循环注射用水案例中的一个成功典范。
该项目中的高温注射用水系统应用于CIP工作站、洗瓶机和GMP清洗剂等工作岗位（5个高温WFI用点），常温注射用水系统应用于器具清洗、培养基配制、缓冲液配制、冻干/制剂配制、纯化与超滤冲洗，以及消毒液配制等工艺岗位（24个常温WFI用点）。车间生产结束后，热储存、常温循系统自动切换为热储存、热循环系统，有效解决了常温用水与能耗之间的矛盾，该系统已经经历了长达两年的连续运行与监控，微生物、电导、TOC和内毒素等各项关键质量均非常稳定（图5），该系统的相关设计、建造、运行和监控数据得到了相关药监部门、美国礼来公司的审计与认可。
“热储存、旁路常温循环注射用水系统”是一种用于高端生物制药生产的创新设计思路，它颠覆了我国传统的高温循环设计思路：极大的节约了冷却水等公用工程的需求量，为我国治污治霾提供了帮助；同时，使用点无需安装体积庞大热交换器，无需瞬时降温，即开即用，极大的方便了生产操作。初步估算，该设计可以为生物制品生产车间每年能节省约200万运行成本，以我国高端生物制药企业注射用水分配循环系统数量500套为例，每年能为制药行业及国家节省冷冻水等高能耗运行资金约10亿元人民币。未来，“热储存、旁路常温循环注射用水系统”与“在线微生物检测技术”相结合，将有助于生物高端制药企业及药监部门对节能型注射用水设计思路的进一步认可，有助于改进制药用水系统运行、降低成本和保证水质。
十年前，在线TOC仪器的认识与应用在国内还属于空白，笔者有幸于2008年被奥星公司派往ISPE亚太总部新加坡参加了一次“ISPE制药用水与蒸汽系统高级培训班”课程，并第一次接触到了在线TOC技术，现在，制药用水系统与在线TOC仪器在国内的密切结合程度已经家喻户晓。十年一个轮回，笔者认为，很可能与在线电导、在线TOC的发展轨迹一样，“在线微生物检测技术”将在接下来的十年时间内为中国、乃至世界的制药用水微生物检测技术带来划时代变革。
在线微生物检测仪通过实时的监控实现更好的过程控制和产品安全性，真正做到了自动化控制领域提倡的“过程监控技术”，可以预见的是，在线微生物检测仪将与在线电导率仪、在线TOC检测仪的发展历程一样，会得到越来越多的制药企业的青睐与应用，同时，该技术的发明也将推动相关法规规范的完善发展。
参考文献 （1）"Advancing Regulatory Scienceat FDA- A Strategic Plan: August 2011" （2）"Novel Concept for Online WaterBioburden Analysis: Key Considerations,Applications and Business Benefits forMicrobiological Risk Reduction"American Pharmaceutical Review, May/June2013 （3）制药用水系统（中文版），张功臣，化学工业出版社，2016 （4）Pharmaceutical Water Systems（英文版），张功臣，化学工业出版社，2017
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