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[检验及监测] 如何确定加菌量在50-100cfu的稀释级别

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药徒
发表于 2015-3-3 22:15:39 | 显示全部楼层 |阅读模式

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药典规定,在验证培养基适用性时需加入菌在50-100cfu,那么如何确认其稀释级别的问题?
一般情况是,对于新鲜培养物,做不同级别的稀释度,每个稀释度各加1ml于2个平皿,经过规定的温度时间培养后计数。那么问题来了,培养计数,培养时间是48h或者72h。此时,菌液即使在2-8℃保存,至少也是48h。而药典规定2-8℃保存时间不得过24h,常温在2h。
针对这个问题通常情况,各企业是如何做的,希望经验人士给予指导!
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药徒
发表于 2015-3-4 07:26:25 | 显示全部楼层
按照药典规定时间,基本在此范围内。(假定培养一定时间后,菌液浓度基本达到一个相对固定的饱合浓度;不知这样理解对否?另外离开液体环境,在固定时间内的培养计数,也不能象理化指标一样准确,只是个相对可信值?)
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药徒
发表于 2015-3-4 08:24:45 | 显示全部楼层
好像有种标准浊度管来指示菌液浓度的

微生物不太懂,
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药生
发表于 2015-3-4 08:29:11 | 显示全部楼层
让有经验的微生物QC来做
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药士
发表于 2015-3-4 08:57:48 | 显示全部楼层
取一定体积的样品置于血细胞计数器的计数室内,用显微镜观察计数。

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有点复杂。你这样做过吗  详情 回复 发表于 2015-3-4 16:09
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药生
发表于 2015-3-4 09:03:12 | 显示全部楼层
1、加菌前,须检测所加的菌液浓度。
2、菌液在冰箱保存和进行培养那是两回事。

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是的。你也亲自操作过吧?  详情 回复 发表于 2015-3-4 16:10
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药生
发表于 2015-3-4 09:10:24 | 显示全部楼层
用新鲜培养的菌做几个稀释度菌液,使用细菌计数器计数计算菌液浓度,使用合适浓度的菌液做实验,并将此菌液平板计数,确认当时选择是否正确。不正确重新实验。

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是否实际操作过?  详情 回复 发表于 2015-3-4 16:11
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发表于 2015-3-4 09:15:07 | 显示全部楼层
中检院有卖标准比浊管的,说明书上有相关菌种浓度,实验时可按此标准调整菌浓度来满足要求。
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药生
发表于 2015-3-4 10:36:31 | 显示全部楼层
比浊管、细菌计数板都可以用来提前确认菌浓度,最终还要平板计数以证明菌浓度在范围内,以确认实验可靠。
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药徒
发表于 2015-3-4 11:24:11 | 显示全部楼层
培养基适用性验证和菌落计数同时进行,再看计数的结果是否符合要求。
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发表于 2015-3-4 12:09:14 | 显示全部楼层
遇到同样的问题,急切需要知道!
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药徒
 楼主| 发表于 2015-3-4 16:09:24 | 显示全部楼层
红茶. 发表于 2015-3-4 08:57
取一定体积的样品置于血细胞计数器的计数室内,用显微镜观察计数。

有点复杂。你这样做过吗

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这玩意主要是要备材料,复杂倒真不算复杂,怎么都拼不过定量稀释法。比用麦氏比浊管心里有底点,看颜色这些东西,不同人的差异不小。  详情 回复 发表于 2015-3-4 16:20
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药徒
 楼主| 发表于 2015-3-4 16:10:44 | 显示全部楼层
咕咕 发表于 2015-3-4 09:03
1、加菌前,须检测所加的菌液浓度。
2、菌液在冰箱保存和进行培养那是两回事。

是的。你也亲自操作过吧?

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短期操作过  发表于 2015-3-6 16:40
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药徒
 楼主| 发表于 2015-3-4 16:11:35 | 显示全部楼层
先亮 发表于 2015-3-4 09:10
用新鲜培养的菌做几个稀释度菌液,使用细菌计数器计数计算菌液浓度,使用合适浓度的菌液做实验,并将此菌液 ...

是否实际操作过?
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药士
发表于 2015-3-4 16:20:00 | 显示全部楼层
cgycxd 发表于 2015-3-4 16:09
有点复杂。你这样做过吗

这玩意主要是要备材料,复杂倒真不算复杂,怎么都拼不过定量稀释法。比用麦氏比浊管心里有底点,看颜色这些东西,不同人的差异不小。
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药徒
发表于 2015-3-6 11:15:41 | 显示全部楼层
现在按药典标准操作的话,阳性对照实验的同时,也需进行菌悬液稀释平板计数,加入阳性对照中菌液相同体积,需菌落生长在50-100cfu内。相当于同步验证。
其余的方法均不能满足在24h内完成实验的要求。
没有用过比浊法进行微生物限度检查,50-100cfu的菌悬液浊度也很小,不好判断合格范围。药检所也不推荐用浊度法。
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发表于 2015-3-6 16:11:06 | 显示全部楼层
用血球计数板进行使用前菌液计数,准确率很高
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药徒
发表于 2015-3-8 19:28:44 | 显示全部楼层
其实这个稀释级别基本是稳定的,假如这次是10-6是50-100cfu.那么以后同法方操作,基本也就是10-6,可以凭借一定的经验。
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药徒
 楼主| 发表于 2015-5-11 14:06:09 | 显示全部楼层
按照药典操作方法基本做了一遍。
1、从菌种冻干安焙管接种到液体培养基,基本上培养18h即可(除黑曲霉接种到改良马丁琼脂培养基斜面,培养5天)。
2、逐步稀释至相应级别,金黄、大肠稀释至10-7;枯草稀释至10-4;黑曲霉稀释度为10-5;白色念珠菌稀释度为10-6;1ml菌液含菌量50-100cfu。
3、分别浇注对照培养基和试验用培养基。
4、计数,计算回收率。
5、试验用培养基的菌落数比对照用的菌落数略多些。
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药徒
发表于 2015-5-14 13:19:38 | 显示全部楼层
其实按照经验,在每次传代制备的菌液,按照梯度稀释,每个梯度都做平板计数,选择合适的梯度,下次在做的话就直接做相对应的稀释级别就可以
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