细菌内毒素检查法--凝胶法试验中注意的问题（一）

沁人绿茶.

《中国药典》2010年版二部将细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度测定法。因凝胶法具有最简单、经济，结果准确，应用最广泛，对干扰不敏感的优点，且当两种方法有争议时以凝胶法结果为准，因此其作为《中国药典》的“仲裁”检查方法，而广泛用于注射剂药品细菌内毒素的检查。很多企业和市地级药检所均已开展此项，现总结几点应注意的问题与大家共同学习：
      1鲎试剂的选择
      1.1鲎试剂灵敏度
       为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。当有影响鲎试剂质量因素（如鲎试剂储存条件改变、性状改变等情况）发生时，需进行灵敏度复核试验。另外，实验用细菌内毒素检查用水也同样须检验合格后方可应用。本实验室在实验中发现曾经有一批规格为25ml的细菌内毒素检查用水有干扰现象出现。所以，提示实验用鲎试剂和细菌内毒素检查用水同样重要，必须满足中国药典附录要求方可用于实验。
       1.2供试品溶液的制备
       某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶质中浸提制成供试品溶液。首先确定供试品的内毒素限值(EU/ml),公式为L=K/M，L为供试品内毒素限值,然后计算出供试品最大有效稀释倍数(MVD)MVD=cL/λ，其中c为供试品溶液的浓度，λ为在凝胶法中鲎试剂灵敏度(EU/ml)。需要说明的是，选择合适灵敏度的鲎试剂可以减少对鲎试剂不必要的浪费，提高工作效率。对于大输液类（如氯化钠注射液等）和粉针剂等常见品种供试品（如维生素C注射液）应用灵敏度较低的鲎试剂（如0.25EU/ml）无干扰情况下，选择此类鲎试剂即可；对于特殊品种（如葡聚糖类、pH值偏大或小等）供试品有一定干扰作用的品种应该选择灵敏度高的鲎试剂（如0.125EU/ml或0.06EU/ml）。但这里需要补充的是，不同品种、不同批次的供试品由于其生产工艺等方面的差异，在鲎试剂的选择上也应该综合考虑。如对供试品本身不确定，选择灵敏度须遵循从低到高的原则。
       2操作条件
       2.1操作熟练程度
       操作时严格按无菌操作法进行，安瓿开启前用砂石划痕，再用75%酒精棉擦拭消毒后将颈部折断，一定要避免碎玻屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应选择合适量程、精度的移液管量取，保证读数准确。应用移液管时应注意不可用洗耳球吹吸液体，以免由于洗耳球反复吹吸污染溶液。我们实验室应用移液管为避免洗耳球的污染利用虹吸原理来吸取液体。操作时，双手避免接触安瓿或试管口，加样后应迅速用封口膜内侧封闭管口，并立即放入恒温保温箱中，且整个操作过程中时间应紧凑，防止微生物的污染，否则易致假阳性的出现。另外需要重点提示的是，细菌内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器上混合15 min，以后每一步稀释前至少混合30 s，因为具有两级活性的内毒素分子在水中呈不均匀分布，如不按要求会造成所稀释内毒素效价偏低或灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确实验结果。
       2.2保温温度
      温度对鲎试剂的灵敏度影响也是很大的,温度过低鲎试剂灵敏度降低，过高则对鲎试剂产生破坏作用。故应严格按照药典的要求，温度控制在(37±1)℃之间，才可获得准确的结果。实验前应将水浴箱或保温箱开启，预先恒温至37℃。本实验室应用的恒温保温仪为细菌内毒素凝胶法测定仪，能充分保证温度恒定，且孔径与安瓿大小合适，减少了保温过程中的影响因素。
       2.3保温时间
       实验过程中，我们发现延长保温时间，可以提高鲎试剂的灵敏度，增加假阳性的发生率。故应遵守我国药典规定的保温(60±2) min时间。在凝胶法操作中应防止试管受到振动，鲎试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判断为阴性。水浴箱要放置在不易受到振动的地方，保温过程中不可随时取出观察，观察结果时，要动作轻柔，缓缓倒转180°，避免引起振动，出现假阴性结果。
       2.4特殊品种的供试品处理
       当供试品用普通细菌内毒素检查用水稀释反复试验均产生干扰等情况时，应考虑选择合适的方法来处理。如供试品（维生素C原料药等）pH值不满足细菌内毒素检查法试验的要求（pH一般为6.0~8.0），我们应用Na2CO3、HCl、NaOH等来调节样品的pH值，之后再进行细菌内毒素检查。如供试品（注射用乳糖酸红霉素等）应用不同厂家0.125EU/ml、0.06 EU/ml的鲎试剂反复实验均产生干扰，之后我们采用了安度斯公司生产的抗增剂来稀释供试品，试验结果成立且供试品符合规定。
       3所用器皿均应彻底洗净和安全灭菌
       实验用器皿均应洗涤并冲洗干净，特别是接触酸碱或洗液等洗涤后，更应冲洗干净，以免残留物干扰实验结果。灭菌方法和时间应严格按《中国药典》中的要求处理，防止引入外源性内毒素。
       总之，为了保证检查细菌内毒素结果的准确性、真实性，操作人员一定要严格按《中国药典》2010年版的有关要求去做,严把药品质量关，保证临床药品的质量。
       [参考文献]
       [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].第二部.北京:中国医药科技出版社,2010.99-102,附录XIE.
来自辽宁省药检所。

酋长

虽然安度斯的鲎试剂确实不错，但中检所也没必要特别注明吧...这让其它生产商情何以堪啊 ....

善变的云

挺不错的资料，谢谢分享

沁人绿茶.

溪河殇 发表于 2013-11-30 23:08
虽然安度斯的鲎试剂确实不错，但中检所也没必要特别注明吧...这让其它生产商情何以堪啊 ....

有宣传的意思

YFCHLH

学习........

彩虹

学习下。。。。。

zzx-2000

学习下。。。。。

吾儿子安

好好学习，天天向上

z344294209

学习！

snowfly_2010

谢谢分享

小飞鱼爱太阳

请教一个问题，如果供试品不做前处理，直接进行稀释到无干扰，那么凝胶限度实验还有必要做吗？