请教各位大佬，ELISA实验的封闭效果不好怎么办

沉迷吃鸡

各位大佬：
       我这边在做一个ELISA的方法开发，基本流程是高吸附板+包被抗原+封闭+洗板+加抗体+洗板+二抗+洗板+TMB+终止，发现封闭效果不好（包被抗原和不包抗原（相同封闭条件），不同浓度梯度样品的响应值是差不多的），后面考察了5%脱脂奶粉，1%BSA、3%BSA、20%脱脂奶粉，血清，商品化封闭液，加吐温，结果是脱脂奶粉+吐温有一点效果，但是也没有办法完全封闭住。
备注：1、换过不同厂家的脱脂奶粉、BSA、二抗
2、高吸附板子是康宁的9018，咨询过厂家是适用于我们产品的分子量
3、封闭条件：试过37℃2h，37℃4h，室温2h，室温4h，37℃2h震荡，室温2h震荡
4、样品缓冲液无结合
5、样品浓度从几毫克做到几微克，基本到几十微克的时候吸收值在0.05以下，但是因为产品问题，抗体跟抗原结合比较弱，用几十微克浓度的抗体，跟抗原结合做不出上平台；抗原浓度做到很高了··再高就要1支抗原铺一个96孔板····
问题：
1、大家有没有其他封闭效果好的方法
2、除了高吸附板+不包被+封闭+抗体+二抗，还有没有别的方法可以确认封闭效果（个人认为抗原也算封闭的一部分，不加抗原的封闭效果肯定不如加了抗原的）
3、结合实验的ELISA的曲线上平台一定要有三个点嘛？有弯曲趋势可以嘛？

依然星期三

ELISA可以用非线性响应

沉迷吃鸡

依然星期三 发表于 2025-2-13 08:50
ELISA可以用非线性响应

可以详细说说嘛老师，我不太理解····

依然星期三

沉迷吃鸡 发表于 2025-2-20 08:08
可以详细说说嘛老师，我不太理解····

四参数拟合，标曲可以是s的，可以是指数的

沉迷吃鸡

依然星期三 发表于 2025-2-20 10:00
四参数拟合，标曲可以是s的，可以是指数的

大佬，现在是做的四参数拟合的，是这样，就是包被受体+封闭+样品+二抗可以做出完整的四参数拟合曲线，R方也挺好，不包被+封闭+样品+二抗也做出了完整的四参数拟合，响应值比包被受体的高了一点，所以觉得是封闭效果不好