微生物限度标准能觉得微生物方法适用性的加菌量吗？

Yhuan12

试验组：
需氧菌总数：分别取5:10供试液10ml，再分别加入0.05ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉以上5种菌悬液（每毫升不大于10000cfu），充分混匀。分别取上述试验菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基（每种试验菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。
霉菌和酵母菌总数：分别取5:10供试液10ml，再分别加入0.05ml白色念珠菌和黑曲霉菌悬液（每毫升不大于1000cfu），混匀。分别取上述试验菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。
以上，霉菌和酵母菌加入菌量控制在5cfu/0.5g
样品质量标准是需氧菌不得过100cfu/g，霉菌和酵母菌不得过10cfu/g。通过这个限值去计算试验组中加菌的浓度。有哪个法规上有这个规定吗？

Yhuan12

微生物限度标准能决定微生物方法适用性的加菌量吗？打错字

wzzz2008

你想多加，还是少加？

八档丶电风扇

Yhuan12 发表于 2024-7-16 14:37
微生物限度标准能决定微生物方法适用性的加菌量吗？打错字

标准跟你加菌量没关系、加菌是方法验证，只要回收率合格就行，不受样品质量标准的影响，标准只是日常检验的标准，一般影响的是样品稀释倍数，

比如你方法验证的时候做了1:40供试液的平皿法，标准是40cfu/g，那你如果只做1个平皿的情况下，只要长菌就是超标，这个时候你可以做多组平皿累计计数，比如做4个平皿，菌落数报告4个平皿的和，这样就可以提高准确度，也避免只要长菌就超标的情况

Yhuan12

八档丶电风扇 发表于 2024-7-16 14:52
标准跟你加菌量没关系、加菌是方法验证，只要回收率合格就行，不受样品质量标准的影响，标准只是日常检验 ...

那第二次涉及的方案就不成立，不管供试品配制的方法怎么样，最后1ml的含菌量都是不大于100cfu的菌落就行。没必要做小于5cfu。就是跟供试品的制备方法有关，霉菌和酵母菌不得过10cfu/g，就只能涉及成1:10的供试液，在此外多做几个平皿，提高准确度。那我涉及的5:10的溶液是不是也是需要提高准确度？

Yhuan12

wzzz2008 发表于 2024-7-16 14:41
你想多加，还是少加？

质量标准是需氧菌不得过100cfu/g，霉菌和酵母菌不得过10cfu/g。设计方案时，霉菌和酵母菌少加了，只加了5cfu

Yhuan12

八档丶电风扇 发表于 2024-7-16 14:52
标准跟你加菌量没关系、加菌是方法验证，只要回收率合格就行，不受样品质量标准的影响，标准只是日常检验 ...

我是没找到哪里有法规规定要这样做。客户说，我们之前做的验证方案未参考EP、USP微生物限度的方法，我们领导指导我改成这样的。我现在写偏差也没找到个出处。

Yhuan12

验证方法
菌落计数采用平皿法。
分别取3份样品各10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，溶解，摇匀，为1:10供试液。
供试液稀释：取1支1ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀，即为1：100供试液。取1支1ml灭菌吸管吸1：100均匀供试液1ml。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。
供试品溶液组：
吸取1：10、1：100二级稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释吸收液时可用1支吸管），每一稀释级注2个平皿中，再分别倾注15~20ml不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，待凝固后在30~35℃培养箱中倒置培养，作需氧菌总数培养；另吸取1：10、1：100二级稀释液各1ml同上操作作霉菌和酵母菌总数培养。注入2个无菌平皿中，分别倾注15~20ml不超过45℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后在20~25℃培养箱中倒置培养。
试验组：
需氧菌总数：分别取1:10供试液、1:100供试液10ml，再分别加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉以上5种菌悬液（每毫升不大于10000cfu），充分混匀。分别取上述试验菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基（每种试验菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。
霉菌和酵母菌总数：分别取1:10供试液、1:100供试液10ml，再分别加入0.1ml白色念珠菌和黑曲霉菌悬液（每毫升不大于10000cfu），混匀。分别取上述试验菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。
菌液对照组：分别于10ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉以上五种菌悬液（每毫升不大于10000cfu），充分混匀。分别取上述对照菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。分别取白色念珠菌、黑曲霉对照菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。按试验组的计数方法测定其菌数。
阴性对照组：分别移取1ml稀释液（pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）至4个平板培养皿，按试验组的计数方法，其中2个平皿倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基，2个平皿倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基，测定阴性对照组。
培养条件：胰酪大豆胨琼脂培养基上的培养物于30~35℃培养不超过3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基上的培养物于20~25℃培养不超过5天。
可接受标准：
试验组菌落数减去供试品溶液组菌落数的值与菌液对照组菌落数减去阴性对照组菌落数的值的比值应在0.5~2范围内。

Yhuan12

Yhuan12 发表于 2024-7-16 16:28
验证方法
菌落计数采用平皿法。
分别取3份样品各10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，溶解，摇匀 ...

这个是之前做的方法适用性方案。

wzzz2008

Yhuan12 发表于 2024-7-16 16:25
质量标准是需氧菌不得过100cfu/g，霉菌和酵母菌不得过10cfu/g。设计方案时，霉菌和酵母菌少加了，只加了5 ...

只能说，你是牛人，居然能准确计数5CFU的菌。

Yhuan12

wzzz2008 发表于 2024-7-16 16:29
只能说，你是牛人，居然能准确计数5CFU的菌。

定量菌株，还是可以做到的。不行就多做几次。

wzzz2008

Yhuan12 发表于 2024-7-16 17:02
定量菌株，还是可以做到的。不行就多做几次。

你应该不是学微生物的吧。
另外，挑数据，是QC最大的忌讳。

八档丶电风扇

Yhuan12 发表于 2024-7-16 16:22
那第二次涉及的方案就不成立，不管供试品配制的方法怎么样，最后1ml的含菌量都是不大于100cfu的菌落就行 ...

方法验证，只要最后1ml的含菌量都是不大于100cfu的菌落就行，你5:10供试液就是1:2，只要你样品的初始污染菌不是多到无法计数，日常检验那就按照正常平民法操作做两个平皿就好了。