【珐成浩鑫杯】细胞治疗产品在商业化阶段如何确定关键质量属性（CQA）

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前言
    细胞治疗产品的关键质量属性（critical quality attributes, CQA）是产品开发的重点之一。尤其是当下，随着部分企业逐渐步入上市申报，工艺变更及可比性研究成为监管侧与企业侧的核心交锋点。CQA作为可比性研究的重要指标，其地位会愈发凸显。但是，细胞治疗产品的特性决定其CQA不同于传统药品或生物制品。因此，如何合理制定CQA就成为了企业上市申报前绕不过的一道难关。

一、 貌似清晰的MOA

    一般来说，CQA的确定需要主要考虑科学性和质量风险管理过程，而科学性考量中首当其冲的就是作用机理（mechanism of action, MOA）。但遗憾的是，细胞治疗产品的一大问题就是作用机理并不清晰。以目前发展最快的CART产品来说，其作用机理表面上清晰，无外乎“scFv识别抗原，T细胞完成杀伤”。但若稍微深入其中，就会发现具体细节其实是一片混沌。以抗原识别为例，scFv到底是如何形成突触来实现抗原识别，其中的关键影响因素又有哪些？倘若把scFv更换一下，轻链-重链换成双重链、或者换成非经典结构比如d-domain protein，形成突触的方式又会有何变化？这些问题都是与作用机理紧密相关的，但同时，也是没有答案的。

    scFv形成突触已经是CART作用机理中比较高深的了，另一个更基础、也更广为人知的例子更能说明问题。我们都知道，T细胞分为CD4+辅助T和CD8+杀伤T两种类型，这是最基础的T细胞免疫学知识之一。那么，在CART抗肿瘤的过程中，CD4+和CD8+分别发挥着何种作用，两者之间又是如何协同作战的呢？没有答案。Juno公司的产品JCAR017将CD4+和CD8+两种细胞按照1:1的比例进行混合，相关研究和临床试验也做了好多年了，至今没有得出结论来确定这个1:1混合到底具不具有临床优势。相反，多个互相独立的临床都发现过CD4+%或者CD8+%接近99%的CART成品回输后患者获得完全缓解的案例，这反而证实了Juno的1:1混合是个似是而非的噱头。那么， CD4+/CD8+比例和抗肿瘤活性之间的关系到底是什么呢？只有老天爷知道。

    作用机理如此不清晰，确定CQA自然就难如登天……吗？

二、 两极分化的CQA

    作用机理如此不清晰，确定CQA自然就难如登天——通常是这样的。
    但细胞治疗不是一个通常的产品。
    从理论上来说，细胞治疗产品的确很难确定CQA。无论是FDA还是CDE都没有在这方面给出任何确定性结论，就是这一论断的最好例证。但在实际工作中，细胞治疗产品又是可以确定CQA的，而且候选参数呈现了明显的两极分化：要么简单到毫无争议，要么复杂得说不明白。
    简单到毫无争议的CQA，除了无菌、支原体等常规药品指标以外（这些并非本文的讨论对象），CART特有的质量属性包括：细胞活率、%CAR+阳性率、CAR拷贝数（vector copy number, VCN）、磁珠残留、杀伤、干扰素γ分泌等等。这些都是广泛认可的CQA，不仅毫无争议，有些还是历久弥新。例如，VCN早在全球第一款CART产品Kymriah申报IND的2009年就已经被确定为产品重要属性，而且还明确质量标准是不超过5 copies/cell。CD3/28磁珠残留更是历经风雨的老资格，在1996年就被FDA特别要求列为细胞产品的考察指标，并且确定了对应标准是每3x106个细胞中磁珠<100个（图1）。令人惊讶的是，这个27年前定下的标准至今依然有效，足以说明其是多么的毫无争议。
上述这些CQA指标的最大特点，一是广泛认可，二是简单好做，几乎没有什么异议，也没什么技术门槛。

图11

图1. CART产品的部分CQA，如VCN和磁珠残留，早在十几年前就已经基本确定了

   

    而与这些简单到毫无争议的CQA相对的，则是另外一大批复杂得说不明白的参数。这些参数个个与CART质量紧密相关，是当之无愧的CQA候选参数——但也仅仅是候选。其中的典型代表，就是自本世纪初一被提出就红遍免疫学界至今经久不衰的明星假设：T细胞亚群。简言之，CART产品由多个T细胞亚群构成，分别称为幼稚、中枢记忆等。不同亚群功能不同，有些杀伤强，有些寿命长，有些对抗肿瘤不仅无益、还起反效果，等等。T细胞亚群比例对CART产品的重要性显而易见，没有人希望自己的产品中都是起反效果的T细胞亚群。那么，我们是否应该将T细胞亚群纳入CQA呢？
    也许应该纳入，但纳入不了。
    T细胞亚群是一个复杂到爆炸的假设。该假设的不同版本在各个学术流派中各行其是，不同研究小组给出大相径庭的数据结果，同一小组的结果在自己主持的临床试验中自己都无法验证，更不必提说推而广之。
太复杂了，复杂到说不清楚，更制定不了清晰、可执行的质控标准。
    体现这一复杂性的一个经典例子发生在笔者之前供职的研究小组。该小组在业界久负盛名，曾动用了大量研究资源与多种研究方法，包括但不限于患者数据大样本分析、多参数流式、全转录组测序、代谢分析、患者元代细胞小鼠模型等，对T细胞亚群进行了系统的研究，数据最终发表在学术顶刊Nature Medicine上（图2）。整个工作过程中，研究人员不可谓不专业，分析手段不可谓不先进，配套资源不可谓不充分，文章档次不可谓不权威。
    那么，结论是什么呢？
    说不明白。
    即使对于能够发表Nature的科研机构，T细胞亚群这个问题依然太过复杂。对我国广大CART从业企业来说，就更是力不能及了。
    换言之，从可行性来说，T细胞亚群根本无法纳入CQA。

图22

图2. T细胞亚群相关研究投入了大量资源，但最终的结果却并不尽如人意

   

    T细胞亚群“说不明白”的状态不是孤立的。T细胞亚群的研究手段之一就是对T细胞表面及胞内的生物标志物（biomarkers）进行高通量检测与综合分析。所以上述研究的连带结论之一，就是生物标志物也是个“说不明白”。而如果进一步去探究这些情况出现的深层原因，就会回到本文的开头：因为CART的作用机理不清晰。作用机理都不清晰，从其中衍生出来的各个问题自然也是一团乱麻了。
    有意思的是，这种两极分化的状态，反倒是让原本很棘手的问题变得好办了。那些简单清晰无可争议的参数，自然全部列为CQA。而复杂到说不明白的参数，就只能委屈一下作为质量研究项目了。
    而这，也就是Kymriah等一众上市产品的CQA列表最终得以确定的秘诀。
    于是，细胞产品CQA这个本身非常复杂的事情，最终迎来了一个无比简单的结局。Kymriah的CQA一共7大项16小项，内容异常清爽，不过就是细胞活率、%CAR+阳性率、VCN、磁珠残留、杀伤、干扰素γ分泌等常规项目（图3）。既有科学性，又有可行性。
    皆大欢喜……吗？

图3. 全球首个上市的CART产品（诺华的Kymriah）的CQA列表

三、差强人意的Potency

    皆大欢喜——至少对于部分人是这样的。
    对于从事GMP或者注册工作的各位，明确的CQA无疑是非常令人欣喜的。做工艺可比性研究的时候可算是有标准了。但是，药厂领导、临床医生以及患者，恐怕都是不满意的。因为对于他们来说，药品最关键的属性就是疗效。那么，CQA这个关键质量属性就应该可以反映、至少部分反映临床疗效。对很多药品来说，这是可以做到的。但对CART来说却很难实现。原因也很简单，上文提到的那么多“说不明白”的作用机理、细胞亚群、生物标志物等等，都是和临床疗效息息相关的参数。
    换言之，真正说不明白又不得不说明白的，其实是CART的效能（Potency）。
    严谨的说，CART的效能是可以说明白的。其中关键在于效能的定义是什么。如果参考FDA的定义，细胞与基因产品的效能（CGT potency）是用来进行产品的特性鉴定、可比性研究、稳定性，并最终保证各临床阶段给患者回输的产品一致、可比。并且FDA还专门明确说过，产品效能（potency）并不等于临床疗效（effectiveness），也不需要能预测临床疗效。所以，上述确定CQA的方式是没问题的，CART产品的效能也是说得明白的。
    但是，领导们、医生们和患者们依然不满意。因为对于不从事GMP和注册工作的人来说，这个解释实在太像是一种诡辩。效能potency和疗效effectiveness明明就是同义词，现在却通过对其给予不同的定义，在没有解决“疗效预测”这一核心诉求的情况下，使整个事件正当化。还大言不惭地说什么“产品效能并不等于临床疗效”。明明就是工作没做到家，找借口的本事倒是一套一套的。
    那么，该怎么解决疗效预测这个核心诉求呢？
    解决不了。
    至少现阶段解决不了。
    CQA和效能的问题，其最最最基础的根源是细胞治疗相关的学术研究并没有进展到足够的阶段。说白了，细胞治疗是一种“实践走在理论前面”的技术。临床层面已经看到疗效了，科研层面却未能阐明疗效背后的机理。这个底层问题反馈到GMP和注册的层面上，就变成了上文提到的CQA那剪不断理还乱的现状。
    随着科学技术的发展，细胞治疗的作用机制迟早是可以说明白的。那也将是行业可以拥有真正完整和准确的CQA的时候。但至少目前，我们依然得要面对目前的现状。在这种情况下，通过将效能和临床疗效两者分开，以保证在符合GMP和QbD大背景的情况下、细胞治疗产品的生产和注册工作得以继续进行，细胞治疗的特殊性得以纳入已有体系之中而继续发展。这既是一种巧妙的监管智慧，也是一个没办法的办法。

小结
    俗话说，“办法总比困难多”。CQA和效能相关问题只是细胞治疗产品特殊性的一个缩影。这些特殊性对监管和被监管方同时提出了挑战。目前，我国监管机构已经针对性的制定了多部政策或指导原则，以更好的适应行业需求、促进行业发展。对业内公司而言，对政策法规的系统性解读可以快速捋清监管要求，为自家产品制定清晰的开发计划，并在注册申报过程中做出正确的决定。

蒲公英征文组

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