小奕说药 | 单抗药物电荷异构体分析和表征

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电荷异构体介绍及表征

目前，抗体类药物大多是通过哺乳动物细胞表达系统进行生产。在产品的生产、储存、运输等过程中，往往会发生产品的聚集、降解以及各种翻译后修饰，从而导致产品的分子大小、电荷、糖型等不均一性及其相应的异构体产生。人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）在Q6B指导原则中根据这些异构体对产品安全性、有效性的影响程度，将其分为产品相关物质以及产品相关杂质。因此对产品相关物质以及产品相关杂质的鉴别、质量研究和质量控制具有重要意义。

一、电荷异构体的概念

研究发现绝大多数修饰均能通过改变电荷基团的数量或结构，使抗体表面电荷发生变化，造成电荷异质性。这些存在电荷异质性的蛋白被称为电荷异构体（Charge Variant）。

图1.抗体常见的修饰和分子量变化

二、电荷异构体的形成原因以及影响

1、主峰的常见成分

主峰并不是无修饰或者无降解的完整的抗体分子，事实上主峰是由几种主要修饰组成，常见成分如表1所示：

表1.主峰（Main peak）的常见成分

2、酸性异构体（Acidic peak）的常见成分

酸性异构体形成的原因主要是分子上酸性基团的引入、碱性基团的丢失以及分子构象的改变。常见成分如表2所示：

表2.酸性异构体（Acidic Peak）的常见成分

3、碱性异构体（Basic Peak）的常见成分

碱性异构体的形成原因主要是分子上碱性基团的引入、碱性基团的不完全切除以及构象的改变。常见成分如表3所示：

表3.碱性峰（Basic Peak）的常见成分

4、其他修饰

还有很多修饰、聚集或者降解引起的电荷改变不固定，视具体情况而定，如表4所示：

表4.其他修饰

三、电荷异构体检测方法

电荷异构体检测是根据抗体所带电荷的差异进行分离检测，常用的检测方法有离子交换色谱（IEX）、毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等电聚焦电泳（cIEF），以及成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）等。在图谱中，与主要物质（Main peak）相比，pI较低的电荷物质称为酸性异构体（Acidic peak），pI点较高的电荷物质称为碱性异构体（Basic peak）。不同的分析方法，酸碱峰的出峰顺序也不同，若采用CEX分离，酸性异构体则在主要物质之前被洗脱，碱性异构体则在主要物质之后被洗脱，而CZE则相反。

图2.抗TNF-α全人源单克隆抗体电荷异质性分析图谱

A：CEX   B：CZE    C：iCIEF    D：cIEF

四、电荷异构体表征方法

如前面所述，色谱法和电泳法常常用来分离电荷异构体，那么如何对电荷异构体进行详细的表征同样是一个难题。

1、在线直接分析

1.1 IEX-MS直接分析

离子交换色谱(IEX) 作为一种经典的电荷异构体表征的分析技术，基于与色谱固定相接触的抗体异构体的表面电荷差异，采用盐浓度梯度、pH梯度或兼顾两者来实现分离。该方法往往需要高浓度盐，与质谱(MS)不兼容，故无法直接表征电荷异构体。但是使用可挥发性盐（如铵盐类），就可以在液相上实现分离的同时兼容质谱检测鉴定。

图3.单抗的IEX-MS图

左：（A：NIST标准品，B：利妥昔单抗，C英夫利昔单抗）IEX图谱

右：A,B,C对应主峰的MS图（未解卷积）

1.2 CE-MS直接分析

近年来毛细管电泳和质谱技术已实现抗体经CE分离后直接进行质谱检测。如下图所示：

图4.zip-chip分离原理、电荷异构体CE-MS直接分离图谱以及CE-MS肽图图谱

以上两种方法均可实现电荷异构体的直接分离后实时分子量检测鉴定，表征不同的电荷异构体的分子量差异，如相差128Da通常是赖氨酸变异。CE-MS可实现肽段鉴定，能够定量更小的修饰。但这两种方法也有其局限性：一是IEX-MS直接分析和CE-MS直接分析只能从完整分子量或者亚基分子量角度分析异构体的不同，定性误差较大；二是两种方法样品量少且不易于在线分离富集用于其他检测；三是高糖基化样品会影响分离度和质谱响应值，并且糖型修饰复杂，会增加定性分析难度。

2、分离收集后表征

由于直接分析方法的局限性，更多情况下会采用分离收集后再表征的方式。

2.1 离子交换（IEX）分离收集

通过IEX方法进行抗体电荷异构体分离，根据出峰时间进行收集，进行浓缩后用于进一步的表征。如图5所示：

图5.IEX分离收集后表征

IEX方法分离规模可以很容易的按比例放大，以收集足够的样品用于质谱分析和活性分析。但是该方法分离度低，难以实现对每个异构体峰精准分离收集，同时富集过程耗时耗力。

2.2 置换色谱（Displacement Chromatography）分离收集

置换色谱是一种非线性色谱技术，是指样品进去色谱柱后，用另外一只一种与固定相作用力极强的置换剂通入色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，流出色谱柱，使得电荷异构体得以分离。如图6所示：

图6.置换色谱分离收集电荷异构体峰

相对于IEX分离收集而言，置换色谱上样量大、产率高、分辨率高、并且分离过程中组分会自行浓缩，省时省力。但是该方法使用的置换剂（如已商业化的阳离子层析置换剂Sachem Expell SP1）成本较高，选择较难，并且伴随碱性异构体的洗脱过程中会有少量置换剂被洗脱，不利于细胞活性分析以及动物实验。

2.3 自由流电泳（FFE）分离收集

在FFE中，蛋白样品被连续引入分离室，并通过流体动力流沿着分离室的长度推动，当样品通过分离室时，垂直于流体流动方向施加电场。分离缓冲液中存在的两性离子产生pH梯度，导致基于电荷异构体的pI值的等电聚焦。将聚焦的异构体推出分离室，并收集成单独的馏分，实现对不同电荷异构体的表征。如图7所示：

图7.FFE分离收集原理、电泳图以及表征结果图

3、 酶解法

虽然馏分收集几乎是彻底表征抗体电荷异构体的第一步，但在馏分收集前可以通过消化酶确定某些修饰对电荷异构体的贡献是多少（如通过唾液酸酶可确定唾液酸对酸性异构体的贡献，CPB酶可确定赖氨酸对碱性异构体的贡献），如图8所示：

图8.抗体经CPB酶切前后IEX图谱

五、电荷异构体对抗体功能的影响

电荷异构体的产生会影响抗体药物的药物代谢动力。

电荷异构体对药物代谢动力学的影响

目前普遍认为抗体电荷变异对其药效学影响并不显著。基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代等方面的影响做过一个总结，结果表明：

①当电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；

②增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除；

③降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除。

图9.电荷异构体的血清浓度（A：静脉注射  B：皮下注射）

六、总结

在单抗产生过程中，消除酸碱异构体是不可能的，也是没有必要的。有一些可能是重组单抗所特有的修饰，有一些是与特定的宿主表达系统相关的。并且对生物功能的影响取决于修饰的部位和水平。对于Fc非关键位点的修饰，即使存在更高水平的修饰也可能不会对结合亲和力产生显著影响。同样，位于Fab区的修饰可能不会影响Fc相关功能。但是，评估酸性或碱性异构体与主要物质在稳定性和功能性方面的差异是有必要的，并且抗体异质性的程度也反映了抗体生产工艺的一致性，因此对电荷异构体的表征和质控至关重要。

参

考

文

献

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xqliu

学习了，谢谢提供分享。

奕安济世生物药

xqliu 发表于 2023-4-3 15:22
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感谢您的关注，共同学习交流

yanhongli11

学习了，谢谢提供分享。