小奕说药丨关键质量属性（CQA）评估（1）：蛋白质聚集

奕安济世生物药

什么是关键质量属性（CQA）？

质量源于设计(QbD) 是一套系统的、 基于充分的科学知识和质量风险管理的研发方法， 从预先确定的目标出发，强调对产品和工艺的理解以及工艺控制。对疾病状态和药物分子属性，对生物学作用机制及安全性影响的全面认识是QbD的基础。制造工艺的设计应保证能够持续生产出符合预期质量的产品，因此需要全面理解工艺是如何影响产品质量属性，才能确保进行有效的工艺设计和有效控制策略的开发。

因此对产品关键质量属性（CQA）的评估就非常重要。ICH Q8（R2）中对CQA的定义为：物理、化学、生物学或微生物的性质或特征，其应在适当的限度、范围或分布内，以保证产品质量。关键质量属性确定的标准是基于药品在不符合该质量属性时对患者所造成危害（安全性和有效性）的严重程度。

CQA评估是药品研发的要素，贯穿于药品研发的生命周期。它也是产品开发的中心，因为它影响控制策略、放行和稳定性质量标准、工艺表征、验证和可比性研究。

评估采用工具

较常使用的CQA风险评估工具有RRF (Risk Ranking and Filtering)、PHA (Preliminary Hazards Analysis) 和PQAA (Product Quality Attribute Assessments) 等。不同的评估工具因其设计原理不同，部分情况下评估结果可能会有所差别，但是CQA的评估更重要的是对其所掌握的既有认知的全面程度和针对特定产品开展的探索研究的深入程度，所以在本文中我们将选取一个使用较为简单的风险评估工具PQAA进行讨论。

PQAA[1]评估工具是关于严重性程度的评分方式，它从免疫原性、非免疫原性安全性、药代动力学和效价这四个影响药物安全性和有效性的因素进行分别评估，最终评估分数取四个影响因素评估分数的最大值。评分分别为9分-严重影响（对患者造成重大伤害）、7分-主要影响、5分-中等影响、3分-轻微影响、1分-不显著影响（预期没有影响）。下表1是PQAA安全因子严重性评分表，为如何对CQA进行评分提供了指导。

表1. PQAA安全因子严重性评分表

蛋白质聚集

蛋白质聚集是蛋白质内部结构发生变化（如错误折叠、构象改变）而形成聚体的生物学现象。蛋白质聚集在蛋白类药物产品的生产制造过程的各个阶段：发酵、纯化、制剂、储存、甚至给药过程中无处不在，形成的聚集体对产品的质量、安全性及有效性的潜在负面影响，严重影响蛋白的质量指标和生产应用。在生物制药领域，蛋白质聚集是药物研发和商业化过程中的重要挑战之一。

蛋白质聚集的CQA评估

以下我们将通过既有知识，对一般情况下的蛋白质聚集对于药物的安全性和有效性的影响评估进行论述，并通过PQAA评估工具进行风险评分，最终确定蛋白质聚集是否属于CQA。需要说明的是，依据既有知识的评估结果无法替代具体产品的实际情况，所以这里只是一种评估演示。

1、安全性

关于蛋白质聚集、抗药物抗体（ADAs）和免疫原性之间的关系已经在体外、体内和临床研究中得到了广泛的研究[2]。虽然聚集对ADAs的影响以及ADAs与临床免疫原性之间的关系通常是独立研究的，但蛋白质聚集对免疫原性的贡献是确定的[3]。

研究者通过剪切应力、加热、摇晃和反复冻融来诱导抗体的亚可见聚集，研究这些聚集物在体外激活树突状细胞(DCs)的影响。研究发现，在体外试验中，亚可见聚集物会上调树突状细胞上的共刺激分子，从而诱导了体液免疫反应[4]。

有对已批准药物由于ADA 反应而导致的不良结果的发生率进行报道。例如，在数百名类风湿关节炎患者中，产生了抗阿达木单抗的ADA，这与药物血清水平降低和治疗反应丧失有关[5][6]。

蛋白质聚集物在治疗性蛋白产品的免疫反应方面的风险，还需要关注那些与临床不良反应相关的免疫反应：如抑制产品功效的中和抗体，或更糟的是，交叉反应性中和内源性蛋白质副产物；以及严重的即时超敏反应，如过敏反应[7]。

综上所述，聚集体具有较高的免疫原性，能增强免疫反应，并能产生ADAs，因此评估免疫原性为“主要影响（7分）”；同时，聚体还会产生除免疫反应风险之外的其他临床不良反应，因此对非免疫原性的评估为“中等影响（5分）”。

2、有效性

文献报道，在不依赖T细胞的途径中，蛋白质聚集体可以直接激活B细胞，从而导致短寿命的浆细胞，最终导致ADAs(主要是IgG2b、IgG3或IgM)。ADAs可分为非中和亚型和中和亚型。非中和的ADAs结合在不干扰蛋白药物与其靶点相互作用的表位上。另一方面，中和ADAs会干扰药物的活性部位，从而降低其功效[8]。

蛋白药物产品中形成的可溶性或不可溶性聚集体(颗粒)是一个重大挑战，因为聚集体的生物活性会明显降低。文献报道了IFN-γ多聚体形式下的抗病毒活性要比低聚体形式下的低4-8倍[9]。

相关文献报道[10]，由于免疫反应而导致的ADAs可能会对疗效产生不同程度的影响，生物治疗药物的药代动力学和药效学也会发生改变[11]。

综上所述，聚集体会由于免疫而产生对药效的影响，因此评估为“中等影响（5分）”，没有文献对聚集体与药代动力学的直接关系进行报道，由ADAs而会间接产生对PK的影响，因此对药代动力学的评估为“轻微影响（3分）”。

3、风险评分

综上，依据既有知识并采用PQAA评估工具，对蛋白质聚集的最终风险评分为7分（详见下表），因此蛋白质聚集属于蛋白质药物的关键质量属性。

表2. 聚集严重性评分（使用PQAA评估工具）

参考文献

[1] Flynn G C ,  Nyberg G B . Using Quality by Design Principles in Setting a Control Strategy for Product Quality Attributes[J]. ACS Symposium Series, 2014:117-150.

[2] Singh SK. Impact of product-related factors on immunogenicity of biotherapeutics. J Pharm Sci. 2011;100(2):354-87.

[3] FDA, Guidance for industry: immunogenicity assessment for therapeutic protein products. 2014

[4] Rombach-Riegraf, V., et al., Aggregation of Human Recombinant Monoclonal Antibodies Influences the Capacity of Dendritic Cells to Stimulate Adaptive T-Cell Responses In Vitro. PLOS ONE, 2014. 9(1): p. e86322.

[5] Bartelds, G.M., et al., Development of Antidrug Antibodies Against Adalimumab and Association With Disease Activity and Treatment Failure During Long-term Follow-up. JAMA, 2011. 305(14):p. 1460-1468

[6] Bartelds, G.M., et al., Clinical response to adalimumab: relationship to anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases, 2007. 66(7): p. 921

[7] Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. AAPS J. 2006;8(3):E501–7.

[8] Sorensen, P.S., et al., Is the treatment effect of IFN-β restored after the disappearance of neutralizing antibodies? Multiple Sclerosis Journal, 2008. 14(6): p. 837-842

[9] Arakawa T, Alton NK, Hsu YR. 1985. Preparation and characterization of recombinant DNA-derived human interferon-gamma. J Biol Chem 260:14435–14439.

[10] Singh SK. Impact of product-related factors on immunogenicity of biotherapeutics. J Pharm Sci. 2011 Feb;100(2):354-87.

[11] Coupling of Aggregation and Immunogenicity in Biotherapeutics:T- and B-Cell Immune Epitopes May Contain Aggregation-Prone Regions.

九五二七

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xqliu

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