【珐成浩鑫杯】体外细胞培养的培养基要求

大输液的小兵

体外细胞培养的培养基要求

细胞培养我喜欢用一句话来形容”简约而不简单”，虽说流程就寥寥几步，但稍不留神，细胞就不明不白“闹起脾气”。不是细胞污染，就是活力不佳，再或长着长着就不再是最初的模样。

体外培养的细胞与正常生长环境下的异化，细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生分化现象减弱，形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡，或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

体外培养的细胞分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如 Friend 细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。

细胞培养的培养基要求：细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，就是人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中可以有正常生长和繁殖的能力。培养基是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。

随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展，作为细胞培养领域中最基本的原料－细胞培养基的用量也迅速增加，被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域，如疫苗生产（人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等，兽用疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等），基因药物生产（如 EPO、TPA 等），临床用单抗（如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3）等。

体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。

细胞培养培养用水的要求：体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。例如用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应超纯水机制出的超纯水。最后能随用随制备，减少在储存过程中的污染机率。

体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因 子、激素、渗透压、pH 等诸多方面的要求。pH 气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于 95％空气加 5％二氧化碳的混合气体环境中培养。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的 pH 有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH 值约在 7．2~7．4℃

在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变 酸，PH 值发生变化。由于NaHCO3 容易分解为二氧化碳，很不稳定，致使缓冲系统难以精确 地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。培养基中我们除了碳酸氢钠外，还应使用HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸，是一种常用的两性离子缓冲液，在37°C下的pKa为7.3），如果需要，HEPES可以以10mM至25mM的最终浓度添加到细胞培养基中，以提供额外的缓冲能力。HEPES 结合碳酸氢钠使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止 pH 值迅速变动，但最大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。

造成 pH 波动主要是代谢产生的 CO2，在封闭式培养过程中 CO2 与水结合产生碳酸，培养基pH 很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了 NaHCO3-CO2 缓冲系统，并采用开放培 养，使细胞代谢产生的 CO2 及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中 CO2 浓度（5％），与培养基中的 NaHCO3 处于平衡状态。

无毒、无污染 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过 程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。

cell culture

2022.03.21

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