制备液相选择依据

哎呀呀yj

制备型高效液相色谱是利用“吸附-洗脱”的原理极性分离纯化。

高效液相色谱分为正相色谱和反相色谱。正相色谱和反相色谱又分为吸附色谱和极性化学键色谱。正相色谱的洗脱程序一半为梯度洗脱，正相色谱的出峰时间为非极性物质先出峰，极性物质后出峰。繁殖范杏色欧的出峰时间为极性物质先出峰，非极性物质后出峰。由于急性忽而何物更容易被极性固定相所保留，所以正相色谱一般用于分离机型化合物，反相色谱一般适用于分离非极性或弱极性化合物。

反相色谱在使用液相色谱分离中最为广泛。反相色谱是以表面非极性载体为固定相，笔译固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱固定相大多是硅胶表面建和疏水基团，给予样品中的不同组分的疏水基团之间疏水作用的不同进行分离。在生物大分子分离中，采用的流动相一般为添加一定量缓冲盐的低离子强度得水溶液，再与乙腈或甲醇一定的比例混合。一般都是使用两个色谱泵来分别抽取不同溶剂，混合均匀后输送进色谱柱。

制备型高效液相色谱同分析型高效液相色谱一样，色谱柱是最核心的部分。现在的制备型高效液相色谱柱有以下特征：1、色谱柱内径长，柱长短，外形呈圆饼装。2、色谱柱填料颗粒较小，分布范围很窄。3、流动相流速较高，以便于提高样品浓度。

对于一个未制备过的样品，需要先选择分离模式。一般选择分离模式根据以下基本原则。对于分子量小于2000的样品来说，根据样品是否溶于水还是溶于有机溶剂。假如溶于有机溶剂，例如正庚烷，考虑使用硅胶的正相模式或使用键合相的正相模式进行分离。如果溶于甲醇或溶于乙腈或甲醇/水或乙腈/水等使用键合相反相模式进行分离。如果溶于四氢呋喃，可以使用键合相的反相模式或低分子凝胶渗透色谱进行分离。如果溶于水则一般使用反相色谱进行分离。对于分子量大于2000的样品，如果溶于有机溶剂一般用凝胶渗透色谱[19]进行分离。如果溶于水，一般使用大孔填料的反相模式或大孔调料的离子交换模式进行分离。

现在常用的制备型高效液相色谱柱填料有：

(1)Al2O3基质。使用该基质制成的色谱柱对强酸强碱的稳定性都很好，工作时的pH范围是1-14。但是化学修饰较为困难。

(2)聚合物基质。使用该基质制成的色谱柱对强酸强碱的稳定性都很好，工作时的pH范围1-13；可进根据不同色谱的需求进行表面化学。但是该基质孔径结构复杂，孔径分布范围广，导致柱效不够高；另外，使用的有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨或受损。

(3)硅胶基质。该基质是目前使用最广泛的基质材料，使用该基质制成的色谱柱机械强度高。比表面积高，在中等pH条件下对强碱物质分离度高，分离速度快，重现性好，可利用不同的表面键合反应来满足正相、反相、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。但是硅胶基质工作的pH范围是3-8，在过低或过高的pH下都容易溶解。而且带酸性的硅羟基和碱性表面易导致强碱物质拖尾[20-22]。

影响C18色谱柱性能的物理因素有：

(1) 硅胶纯度。硅胶纯度是指硅胶填料的纯度和硅胶残留的金属离子浓度。硅胶纯度对强极性化合物的分离有较大影响。A型硅胶（硅胶纯度较低）：是由金属硅酸盐制备而成，残留金属含量较高，可用作中性化合物和非离子化合物的分离。但由于带负电荷的残留硅羟基和碱性表面上金属含量高（硅羟基的PKa低，金属离子使硅羟基酸性增强50倍），容易导致分离碱性化合物时色谱峰拖尾。B型硅胶（硅胶纯度高，酸性较弱的硅胶）：通过无金属的工艺制备而成，只含有微量的金属。适合分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。

(2) 色谱柱尺寸对色谱分离的影响：短柱(2.1 mm)检测器灵敏度高；宽柱径(3-21.2mm),载样量高。

(3) 当使用黏度较大的流动相，如50：50=MeOH：H2O时，球形颗粒可降低柱压，延长色谱柱寿命。

(4) 较小的颗粒柱效高，但会引起柱压过高。3.5 um粒径的常用于分离复杂的多组分样品，而组分单一的样品多采用5 um的粒径。

(5) 高表面积对于多组分样品的分离具有较强的保留能力，柱容量和分离度。表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态，对于梯度洗脱尤为重要。

(6) 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间，达到充分分离，改善峰形[23-26]。

影响C18色谱柱性能的化学因素有：

(1) 键合类型。单键键合-键合相分子与基体单键相连，单齿键合提高传质，加快色谱柱平衡。聚合体键合-键合相分子与基体多点相连，双齿键合，增加色谱柱稳定性，增加色谱柱的载样量。填料稳定性提高了，组分的保留时间重现性就好。

(2) 碳含量。即为填料中的含碳量，传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂，然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算碳含量。高碳覆盖率能提高分辨率，同时分析时间延长。低碳覆盖率能够缩短运行时间。可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量[27]。含碳量的增加有利于不易保留化合物的分离。但是不能单独以碳含量来预测色谱行为，它还与硅胶的密度，键合相的密度，填料的表面积等有关系。

(3) 封端。封端能减轻待测组分与硅胶表面残留的酸性羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象，对于极性样品[28-32]，未封端与经过封端处理的色谱在性能上有明显差异。

小金库

感谢分享