[多肽合成专帖] 多肽（PEPTIDE）合成和20个氨基酸概述

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[多肽合成专帖] 多肽（PEPTIDE）合成和20个氨基酸概述

肽

又称缩氨酸，是介于氨基酸和蛋白质之间的物质。氨基酸的分子最小，蛋白质最大，两个或以上的氨基酸脱水缩合形成若干个肽键从而组成一个肽，多个肽进行多级折叠就组成一个蛋白质分子。蛋白质有时也被称为“多肽”。
肽是精准的蛋白质片断，其分子只有纳米般大小，肠胃，血管及肌肤皆极容易吸收。二胜肽（简称二肽），就是由二个氨基酸组成的蛋白质片断。

分类
常见的有二肽（Dipeptide），三肽（Tripeptide），甚至多肽（Polypeptide）等，而2~20胜肽属于寡肽（Oligo-peptide），20~50肽属于多肽，通常十肽以下者较具医药及商业实用性。


多肽（PEPTIDE）

一般指由2～20个氨基酸单位用肽键互相连接构成的长链物质，具直链或环状结构。20个以上氨基酸组成的多肽与蛋白质无明显界限。一般把只含有数十个或更少个氨基酸单位的多肽叫做肽，把氨基酸单位比较多的多肽叫蛋白质。

结构
肽（Peptide）是由氨基酸的胺基（-NH2）和羧基（-COOH）脱水缩合形成肽键后，形成的链状分子。
肽键是由一个氨基酸与次一氨基酸的胺基，行脱水缩合反应而成的-CO-NH-键，具有双键的性质,与邻近共六个原子在同一平面上,因此C-N不可自由转动，肽键是构成蛋白质架构的连系带。

常把多肽中的氨基酸单位叫做氨基酸残基，因为这些单位在互相连接时已失去分子的一部分，而不是完整的氨基酸了。只有肽链两端的氨基酸残基才含有自由的α-氨基或自由的α-羧基。有自由α-氨基的末端残基叫做氨基末端（或N端）残基，有自由α-羧基的末端残基叫做羧基末端（或C端）残基。

命名

给多肽命名时按照从N端到C端残基的顺序，书写时也按这个顺序。

如Ser·Gly·Try·Ala·Leu这个五肽含有5个氨基酸残基和4个肽键，叫做丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸。

功能

肽广泛存在于动植物组织中，其中有许多肽在生物体内有特殊的功能，统称生物活性肽。近年来发现：几乎所有生命科学的重大理论，如免疫防御、生殖控制、肿瘤病变、抗衰防老等都涉及有关的活性肽。这些理论问题无不与临床医学实践密切相关，所以生物活性肽在实际应用上也具有重要意义。生物活性肽的种类很多。如可刺激肾上腺皮质发育的促肾上腺皮质激素是39肽，可使子宫收缩的催产素为九肽，具有吗啡活性的两种重要的脑啡肽均为五肽。许多抗菌素也是肽类物质。又如生长因子受控于基因，在细胞发育过程中起调节和控制作用。这类重要物质为多肽。表皮生长因子含有50个氨基酸残基，神经生长因子由118个氨基酸残基组成。

有不少多肽，特别是动物多肽具生物活性。如毒蕈Amonitaphalloides（Fr．）Secr．中的α、β-毒蕈环肽具降压作用，白花蛇舌草中的催产肽，人参中抗脂质分解的多肽．水蛭多肽有抗凝血作用，蛙皮多肽有舒张血管作用。

其他

多肽一般可溶于水，在热水中不凝固。
多肽在-20℃很稳定，特别是冷冻干燥并保存在干燥器中，在将它们暴露于空气之前，冷冻干燥多肽可以放于室温。
对于含半胱氨酸，甲硫氨酸或色氨酸的肽，脱氧缓冲剂对其溶解必不可少，这类肽易于空气中氧化。
含谷氨酰胺或天冬酰胺的多肽也容易降解。

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[多肽] 组织多肽抗原 Tissue Polypeptide Antigen.TPA


临床意义
TPA的分子量17,000～43,000，由B1、B2和C叁个亚基组成，其活性主要在B1。
TPA主要存在于胎盘和大部分肿瘤组织中，各种恶性肿瘤（卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、睾丸肿瘤等）患者血清TPA的检出率（以>130U/L血清为阳性）可从20%至90%，有人认为高达80%～100%，它的存在与肿瘤发生部位、组织类型均无相关性。

正常人阳性率4.7%。但有相当一部分非恶性肿瘤患者血清中有TPA存在，其阳性率约为14%～35%，以下呼吸道、肝及尿路感染者多见，故TPA亦非肿瘤所特有的标志。但在恶性肿瘤者中，TPA的增高往往是持续性的，因此，若进行连续监测，常常有利于恶性肿瘤与非恶性病变的鉴别。

TPA作为一项肿瘤标志尚有以下临床意义：肿瘤患者术前TPA增高非常显着者，常提示预后不良；经治疗病情好转后，TPA量再次增高，提示有肿瘤复发；与CEA同时检测可明显提高乳腺癌诊断的正确性，有腹于恶性与非恶性乳腺病变之间的鉴别诊断。

正常值：<120U/L血清（酶联免疫法）
化验取材： 血液
化验方法：肿瘤免疫检测
化验类别一：血清学检查
化验类别二：肿瘤免疫检测
参考资料：《新编临床检验与检查手册》、《新编化验员工作手册》

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[氨基酸] 20种标准氨基酸（Standard amino acids）：名称与符号


标准氨基酸（英语：Standard amino acids）或称蛋白氨基酸（proteinogenic amino acids），是生物细胞中用来合成蛋白质的共20种氨基酸。

下表中显示各中文名称与英文名称、三字母符号与单字母符号。除了以下标示之外，有一些符号可用来表示未明确定义的缩写，例如：
Asx与B可同时代表天冬氨酸（Asp、D）或天冬酰胺（Asn、N）。
Glx与Z可同时代表谷氨酸（Glu、E）或谷氨酰胺（Gln、Q）。
Xle与J可同时代表亮氨酸（Leu、L）或异亮氨酸（Ile、I）。
中文名称        英文名称        短写          缩写
丙氨酸        Alanine        A        Ala
苯丙氨酸        Phenylalanine        F        Phe
半胱氨酸        Cysteine        C        Cys
硒半胱氨酸        Selenocysteine        U        Sec
天冬氨酸        Aspartic acid / Aspartate        D        Asp
天冬酰胺        Asparagine        N        Asn
谷氨酸        Glutamic acid / Glutamate        E        Glu
谷氨酰胺        Glutamine        Q        Gln
甘氨酸        Glycine        G        Gly
组氨酸        Histidine        H        His
亮氨酸        Leucine        L        Leu
异亮氨酸        Isoleucine        I        Ile
赖氨酸        Lysine        K        Lys
吡咯赖氨酸        Pyrrolysine        O        Pyl
蛋氨酸        Methionine        M        Met
脯氨酸        Proline        P        Pro
精氨酸        Arginine        R        Arg
丝氨酸        Serine        S        Ser
苏氨酸        Threonine        T        Thr
缬氨酸        Valine        V        Val
色氨酸        Tryptophan        W        Trp
酪氨酸        Tyrosine        Y        Tyr

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多肽合成方法


多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对的固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。
    固相合成方法具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。固相多肽合成现在使用的主要有两种策略：BOC和FMOC两种。BOC方法合成过程中，需要反复使用TFA脱BOC，而且在最后从树脂上切割下来需要使用HF，由于HF必须使用专门的仪器进行操作，而且切割过程中容易产生副反应，因此现在使用受到实验条件限制，使用也逐渐减少。FMOC方法反应条件温和，在一般的实验条件下就可以进行合成，因此，也得到了非常广泛的应用。


固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。
多肽的不稳定
多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一，其原因较多。但对某一个多肽来说引起不稳定的主要原因并不多。详细研究外界条件（如PH、温度、光照、氧浓度等）对多肽稳定性的影响有助于设计合理的制剂配方。尽管添加剂稳定多肽的机制还不十分清楚，使用添加剂仍是目前提高多肽制剂稳定性的主要手段之一。应用CD、DSC等分析手段可帮助快速筛选道合适的添加剂。
引起多肽不稳定的原因
1. 脱酰胺反应
在脱酰反应中，Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应的进行。在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。
2. 氧化
多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。
3. 水解
多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly 肽键。
4. 形成错误的二硫键
二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。
5. 消旋
除Gly外，所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。
6. β-消除
β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β-消除，温度和金属离子对其也有影响。
7. 变性、吸附、聚集或沉淀
变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题，如riL-2在进行曲灌注时会吸附在管道表面，造成活性损失。
提高多肽稳定性的途径
1. 定点突变
通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。
2. 化学修饰
多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。
3. 添加剂
通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween、Pluronic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。
4. 冻干
多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。

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多肽液相合成


基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上，合成一步步地进行， 通常从合成链的C端氨基酸开始，接着的单个氨基酸的连接通过用DCC，混合炭酐， 或N-carboxy酐方法实现。Carbodiimide方法包括用DCC做连接剂连接N-和C-保护氨基酸。重要的是， 这种连接试剂促接N保护氨基酸自己炭基和C保护氨基酸自由氨基间的缩水，形成肽链， 同时产出N，N?/FONT>-dyaylcohercylurea副产物。 然而， 此方法因其导致消旋的副反应，或在强碱存在时形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影响。庆幸地是， 这些副反应能最小化，如果还不能完全消除。方法是加入象HoSu或HoBT这样的连接催化剂， 此外，此方法也可用于合成N保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与任何别的C保护氨基酸或肽反应形成新的肽。
当从副产品, diaydohexylurea分离活性酯有困难时，可用混合Carbonic酐方法， 此方法由两步组成，第一步是在有tertiary碱的有机溶剂中用适当的酰基氯激活Nx保护氨基酸的炭基，第二步是让肽或氨基酸的自由氨基与Carbonic酐反应。Carbonic酐通常加到自由氨基的14倍。
虽然此方法在低温时高效高产，产品纯， 但也有其缺点， 例如，由羰基的强激活酐衍生物有消旋倾向。然而此问题在使用Nx-α-Urethane保护基（Cb2, 或tBoc）时便不会发生。进一步： 由于高反应性， 混合Carbonic酐 倾向5(4H)-oxagolomes, Urerbanes diacyimide, 酯的形成， 并易失调。
促进这些副反应的条件是高温，延长激活时间（即，混合酐形成后， 加到alkylchlorocarbonate和amine成份的时间，amine组成的空间占位，平共处和混合酐的不完整形成。大多这些副反应， 除形成哑唑酮和脲烷外，可通过低温进行反应（~-15℃），大为减少，并且缩短活化时间（~1-2分钟）。为了使哑唑酮和尿烷形成最少，要实行如下措施：1）必要性须用无水有机溶剂，乙酸，四氢 喃，t-butand, 或acetonitrile; 2） 应使用tertiary碱和N-methglmorpholine；3） 必须用C b2或tBoc N- α保护氨基酸。
虽然用isobutyl-和ethylchlorocarbonate常用来形成羰酐， 但确有别的连接试剂，例如，EEQD和IIQD用来与CarboxaP成份反应形成erhyl-或isobutyl carbonate衍生物。 不同于传统酐程序，EEQD和IIQD不要求碱，也不要求低温，通常要求一种有机溶剂（有许多也用）中0.1-0.4M浓度的等摩尔量的羰和氨成份。之后EEQD或IIQD多加5-10%, 温合液室温搅拌15-24小时。真空除去溶剂后，残留物溶于乙酸， 用1NHaHCO3 , 10% 枸橡酸和盐水洗剂，之后用无水Na2So4干燥，蒸发，产品可以重晶结或层析纯化。
液相反应特点
大多数的经典化学反应都是在溶液中进行的。 因此，
　　(1)在溶液相合成中，可以使用先前所有的有机合成方法而没有任何的限制；
　　(2)反应物均一混合并且快速移动使得反应机会增加；
　　(3)在加热反应的例子中，热能通过溶液中的分子分散而被均匀转移；
　　(4)大量反应可以通过控制反应釜的大小和反应物的数量而实现；
　　(5)可以在每个步骤提纯并且分析反应化合物。
但是，也有一些缺点，
　　(1)在反应完成之后，需要的化合物和副产物都一起在反应混合物中，需要溶液化学中的分离步骤。
　　(2)如果使用过量试剂以获得高产量，需要提纯试剂。
　　(3)如果起始物质或副产物(或需要的化合物)易挥发或沉淀，那就容易多了，可是，如果这些不发生，就需要一个比较困难的后处理工作-萃取或色谱。 因此，后处理过程通常需要更多的时间和精力胜于反应过程。
　　(4)自动化溶液相合成由于提纯程序的复杂化而非常困难，因而难以实现。

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多肽固相合成历史

1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖。
今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc：叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基)。以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。
Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等。
多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。
多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。
从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法。
2．固相合成的基本原理
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，具体合成由下列几个循环组成：
　
一、去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去 除氨基的保护基团。
　　
二、激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
　
三、洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA） 洗脱和脱保护。

3. 树脂的选择及氨基酸的固定将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；FMOC合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂。氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DMSO中反应；羧基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肼型树脂，却是加入适当的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。

4. 氨基、羧基、侧链的保护及脱除要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。最早是用苄氧羰基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。1978年，chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脱去，近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；苄酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的S-，用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保护，可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。精氨酸用金刚烷氧羰基（Adoc）保护，用冷的三氟乙酸脱去。固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的失去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。裂解及合成肽链的纯化 BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC法直接用TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。

5. HPLC分析和纯化分析HPLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。HPLC分两类：离子交换和反相。 离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。 分离是一种电荷相互作用，通过可变PH， 离子强度， 或两者洗脱出多肽，通常， 先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱， 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为G4-G8碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而，总体实践中， 这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成， 比如苯基。典型的操作常由两绶冲剂组成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)。大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨，TFA/TEA，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高pH，甚至微碱pH， 因为这样会破坏柱子。

巴西木

谢谢楼主的辛勤工作

质量100分

做过FMOC的飘过~~

Anne

呵呵，内容真的多，要好好的学习了，谢谢楼主

roger1979

谢谢楼主分享

飞过希望

漳州未名博欣生物医药有限公司，专业提供多肽定制合成服务！QQ：578305263

chenheshan

内容很好，以后多沟通沟通的啊。

胜利者

Boc

坚ba1cb9b2

很希望看到这样的文件谢谢

shill2003

很详细，好好学学,感谢楼主。

dasheng1980

谢谢分享

wiNTerz

谢谢分享，希望以后能看到更多这样用心的帖子

LUMINGYONG2011

写的很详细，比较烧脑，谢谢分享

HannahZHANG

讲的非常好，感觉算是扫盲了，感谢~