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电泳图的问题

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发表于 2017-10-9 14:50:16 | 显示全部楼层 |阅读模式

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请问各位大神:最近跑电泳,发现脱色后电泳图中最下面会出现较深的条带(红色圈内),请问这是什么原因 20170911-1.JPG

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药士
发表于 2017-10-9 15:07:27 | 显示全部楼层
如果确认标准品和样品中都没有的话
可能是外源性的东西
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宗师
发表于 2017-10-9 15:35:22 | 显示全部楼层
好多年不做电泳了,个人感觉可以从以下几个方面排除吧:
现象描述:每个点样口对应的地段都出现该情况,一定是系统原因,并非某个样品的原因。
1、是否多次使用了缓冲液,其中某一次电泳后蓝色条带跑完时间太长,导致小分子肽或氨基酸残留在缓冲液中。
2、点样后,忘记启动电泳电源,在放置一段时间后才进行的电泳,可能导致部分小分子肽或氨基酸有所游离;等发现后重新开启电源,小分子肽和氨基酸有可能就最先达到低端。
个人见解,仅供参考!

另外,从百度上搜了一下SDS-PAGE常见问题及回答,发在这里仅供参考,内容如下:
⒈ 配胶缓冲液系统对电泳的影响?
在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素,当然其他的因素也可以从多方面考虑。
⒉ 样品如何处理?
根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1)还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或β-巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。
2)带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min。
3)非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。
⒊ SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用?
聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;
制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.8,分离胶选择pH8.8,选择Tris-HCl系统,TEMED与AP:AP 催化剂,催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺,催凝剂,加速AP催化作用;十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
⒋ 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?
聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。
一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
⒌“ 微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因?
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。
处理办法:待其充分凝固再作后续实验。
⒍ “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因?
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。
⒎ 为什么带出现拖尾现象?
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。此外可能是灌胶时分离胶过多导致浓缩胶很少,不能起到浓缩作用,没有把样品压成一条线。
处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度;灌胶时分离胶不要过多。
⒏ 为什么带出现纹理现象?
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。
⒐ 什么是“鬼带”,如何处理?
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
⒑ 为什么溴酚蓝不能起到指示作用?
我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。
⒒ 为什么电泳的条带很粗?
电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。
处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;
⒓ 为什么电泳电压很高而电流却很低呢?
这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。
处理办法:电泳槽正确装配即可。
⒔ 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?
这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。
⒕ 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?
通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。
⒖ 电泳时间比正常要长?
可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。
⒗分离胶加上后为什么要立即加水?
加入分离胶后,立即覆一层双蒸水,一是为了使分离胶界面保持水平,用水就可以把它压平,使蛋白质分子跑时在同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
⒘连续分离胶体系配制(凝胶板厚度0.75mm,长度10cm)100ml体系:双蒸水37.5ml
尿 素20--50g
10×TBE缓冲液8ml
30%丙烯酰胺10ml
APS(过硫酸铵)500--800ul [注:现配现用]
TEMED(四甲基乙二胺) 23.5ul
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