重视植入前遗传学诊断及筛查技术的安全性

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自1990年世界上诞生第1例植入前遗传学诊断（PGD）试管婴儿至今，已有25年的历史。植入前遗传学诊断是对胚胎进行遗传学分析和诊断，去除有遗传缺陷的胚胎，选择诊断正常的胚胎植入子宫的一种诊断方法。PGD将遗传学技术与辅助生殖技术相结合，将遗传病诊断提前到胚胎植入宫腔之前，避免了因选择性流产给妇女及其家庭带来的伤害。另外，对于反复流产、反复种植失败的夫妇，可以利用植入前遗传学筛查（PGS）技术选择诊断正常胚胎移植以改善临床结局。因此，PGD、PGS在辅助生殖技术中越来越受到重视。

        目前PGD的临床适应证主要包括染色体病、单基因病及性连锁遗传病携带者夫妇等。PGS的临床适应证主要包括高龄、反复流产、反复种植失败、重度少弱精症及高风险遗传病患儿出生倾向的夫妇等。近年来，PGD技术也用于人类白细胞抗原（HLA）配型以挽救同胞血液病患儿及肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌等）相关基因筛查以降低子代患病风险等。PGD、PGS主要步骤包括通过体外受精（IVF）、卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）获得胚胎、胚胎活检、遗传学检测及正常胚胎移植等。随着胚胎活检技术、胚胎玻璃化冷冻技术的成熟以及单细胞遗传学检测技术的发展和新的遗传学诊断技术的引入，PGD、PGS应用范围不断扩大，周期数日益增多，因此，PGD、PGS的安全性愈来愈受人们关注。本文围绕PGD、PGS中活检技术的安全性、常用遗传学检测技术的可靠性及子代安全性等问题进行讨论。

1  胚胎活检时机及其安全性


        胚胎活检是PGD、PGS的主要步骤之一，主要包括胚胎透明带开孔及胚胎活检。根据透明带开孔的方法不同，可分为机械法、化学法及激光法。目前比较常用的为激光法。不同的透明带开孔方法的安全性仍然缺乏大样本的数据及定论。关于透明带开孔方法对胚胎发育的影响，不同的作者有不同的观点。一般认为化学法和激光法的囊胚形成率和囊胚质量无差异，而激光法活检后的胚胎完整性好于化学法。但由于激光法简便、快速和精确，因此是PGD活检的主要方法，但是激光热效应对胚胎发育的影响仍然不容忽视。

        根据胚胎发育阶段，胚胎活检可以分为极体活检、卵裂期活检及囊胚期活检。极体活检指对第一、二极体进行的活检及遗传学分析，间接推测卵子的遗传物质是否正常或者是否携带有致病基因，其局限性是无法分析来源于父方的遗传物质，不能进行性别诊断等。关于极体活检对胚胎发育的影响，Levin等分析了激光法进行极体活检对胚胎发育的影响，结果显示极体活检会导致胚胎碎片增多及细胞数减少，但作者未分析胚胎种植率等数据。

        卵裂期胚胎活检是目前应用最广泛的胚胎活检方法。一般认为卵裂球活检能够反映父源、母源的遗传信息，同时卵裂球是全能的，移去1～2个细胞不会影响胚胎的继续发育潜能。Kirkegaard等报道，卵裂球活检的胚胎其致密化，桑葚胚、早期囊胚等形成时间明显延长，同时活检后胚胎形成囊胚的直径明显减少，透明带厚度明显增加。这些说明活检过程和胚胎细胞数减少对胚胎其余卵裂球的继续分裂存在影响。

        囊胚期胚胎活检被认为是最有前景的胚胎活检方法，这得益于体外胚胎培养系统的完善和囊胚冷冻解冻技术的提高。囊胚期活检的优点主要有：能够提供较多的细胞进行分析，增加了诊断的可靠性，同时活检的滋养外胚层细胞不参与形成胎儿，仅形成胎盘，不危及胎儿的正常发育。其缺点主要是胚胎的冷冻解冻导致的胚胎的损伤等。Scott等比较了囊胚期胚胎活检和卵裂期胚胎活检的胚胎种植率，结果显示卵裂期胚胎活检导致胚胎种植率下降39%，而囊胚期活检并不导致胚胎种植率下降。随着冷冻解冻技术的提高，囊胚期胚胎活检技术在PGD、PGS中扮演愈来愈重要的角色。

2  PGD、PGS中常用遗传学检测技术的可靠性


        胚胎的遗传学诊断是PGD、PGS中重要的步骤之一。传统的单细胞诊断方法主要有荧光原位杂交技术（FISH）和PCR技术。近年来新的遗传学诊断技术不断地应用于PGD、PGS，如微阵列技术及二代测序技术等。PCR主要用于单基因病PGD，同时也用于HLA配型、性连锁基因和性别鉴定等。但是单细胞PCR的局限性主要是容易发生等位基因脱扣（allele drop-out，ADO）或等位基因选择性扩增（preferential amplification，PA），发生率可达10%~25％，严重影响分析结果的准确性。而FISH技术主要用于胚胎染色体非整倍体及性别的检测，其局限性主要是对有限的染色体（10~12对）进行分析，另外对复杂的平衡易位不易做出正确的诊断。同时探针的杂交失败、信号的重叠、分离等都影响诊断结果。Moutou等报道PCR-PGD的误诊率为0.15%，而FISH-PGD误诊率为0.06%。PGD误诊的后果主要有出生遗传病患儿、自然流产及终止妊娠等，这些都给患者带来巨大的影响。因此，PGD误诊情况需要足够重视，尽量减少PGD误诊情况发生。         

        微阵列技术及二代测序技术是近年来应用于PGD、PGS新的诊断技术。微阵列技术主要有微阵列比较基因组杂交（array CGH）和单核苷酸多态性微阵列（SNP array）。array CGH是将基因组中感兴趣的靶点做成微阵列芯片，然后将等量的不同荧光标记的待测和对照基因组DNA与其杂交，根据微阵列每个靶点上两种信号的荧光比率来反映待检测基因组DNA中相对应序列拷贝数的变化。SNP微阵列是应用已知的核苷酸序列作为探针与待测DNA序列进行杂交，通过对信号的检测进行定性与定量分析。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有1个SNP，人类基因组上的SNP 总量大约为3 ×106 个。相对于传统的单细胞诊断方法，微阵列技术属于高通量的检查方法，其主要优点是可以检测胚胎全染色体组非整倍体筛查及结构异常。另外，相比于array CGH，SNP array具有更多的优点如分辨率更高，能检测单亲二倍体、三倍体等。但二者仍然存在缺点，如不能检测平衡性的基因组易位及倒位，同时胚胎活检后的单细胞DNA量（5~6 pg）无法满足进行微阵列分析最少DNA量（200~300 ng）要求，因此，活检后细胞需先进行全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）才能得到上述DNA产量。而全基因组扩增的DNA产物其保真度并非100％，这些都可能会影响到微阵列诊断分析的准确性。Colls 等分析了array CGH诊断结果和再次FISH结果的一致性，显示array CGH进行PGD的误诊率为1.9%。目前尚未见SNP微阵列进行PGD的误诊率的相关报道。

        高通量检测另外一个重要的方法是二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）。它是以大规模并行测序为特征，可一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。NGS当前已经广泛应用于无创产前诊断，同时也在PGD、PGS领域中应用。国内外均可见到NGS应用于PGD的报道。理论上，NGS可以获得基因组的全部信息，通过不同的检测和分析策略，完全有可能实现对植入前胚胎从染色体异常，到单基因突变甚至是新发突变等各个层面的信息。Kung等采用活检的滋养外胚层细胞、卵裂球及已知的细胞系比较了NGS和array CGH，结果显示，NGS的敏感度和特异度均为100%。目前尚未见NGS进行PGD的误诊率的相关报道。随着测序成本的下降和数据分析软件的优化，测序技术在PGD、PGS中有广泛的应用前景。

        由于目前PGD、PGS中的遗传学诊断技术均存在不同程度的误诊率，因此，对于PGD、PGS妊娠后都建议进行产前诊断分析胎儿的羊水细胞，进一步确定胎儿的遗传学上是否正常，最大程度降低PGD、PGS误诊带来的风险。

3  PGD、PGS子代安全性


        PGD、PGS安全性的另外一个重要方面是其子代的安全性。PGD、PGS子代安全性目前仍然缺乏大样本、前瞻性随机对照研究。小鼠PGD模型的研究显示，PGD子代成年小鼠神经退行性病变风险增加，另外研究提示，胚胎活检对小鼠的肾上腺发育有影响，影响小鼠对冷刺激的适应。Strom 等统计资料表明，极体活检或胚胎活检后与自然妊娠相比，孕龄、新生儿死亡率、出生时新生儿体重和身长、出生缺陷发生率及出生后发育状况，差异均无统计学意义。Liebaers等分析了581名PGD或PGS出生后的婴儿发现，出生孕周、出生体重及主要的畸形率与ICSI出生后的婴儿无差别，而围产期的死亡率前者却明显高于后者（4.64% vs. 1.87%），单胎妊娠中PGD与ICSI的婴儿围产期死亡率相近（1.03％和1.30％），而在多胎妊娠中PGD的婴儿围产期死亡率（11.73％）明显高于ICSI（2.54％）。Schendelaar等前瞻性研究显示，PGD、PGS不影响四岁单胎儿童的神经系统、认知功能及行为发育，但是对于PGD、PGS双胎而言，其神经系统发育受到影响。Winter等前瞻性病例对照研究显示，PGD不影响学龄前儿童（单胎）的心理-社会成熟过程。虽然目前对PGD儿童进行流行病学调查未提示胚胎活检影响生长发育，但是模式动物的研究给我们敲响了警钟。

        需要强调的是，对于PGS而言，由于其适应证为低风险的人群如高龄、反复种植失败等，因此在临床应用中更应该予以谨慎对待。在早期的PGS报道中，采用FISH方法分析有限染色体进行PGS的有效性受到了质疑和挑战。现在一般认为FISH-PGS降低临床妊娠率。但是近年来随着全染色体分析技术 （comprehensive chromosome screening，CCS） 的出现（aCGH、SNP array及NGS等），全染色体分析PGS则可以提高胚胎着床率及临床妊娠率。Chen等[13]Meta分析显示，基于CCS方法进行的PGS能够降低流产率，提高胚胎种植率、临床妊娠率及活产率。Dahdouh等的Meta分析也得到了同样的结论。即便如此，PGS的安全性仍然不能忽视。

        综上所述，PGD、PGS为选择遗传学正常的胚胎进行移植提供了可行的方法，但是其面临着诸多的问题如误诊率、子代健康等。总之，PGD、PGS作为一项侵入性的技术，仍然是把“双刃剑”。因此，在临床应用的过程中，重视其的安全性，权衡利弊，合理使用才能更好地造福于人类。

作者：孙莹璞
来源：中国实用妇科与产科杂志

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