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撰稿 | 石决明
来自 | 蒲公英Ouryao
《中国药典》中要求在培养基适用性检查和方法适用性试验的使用标准菌种的新鲜培养物，并详细固定了不同菌种培养的培养基和时间。菌种的新鲜培养物在稀释计数的时候存在不小失败的可能，这时候，定量菌种就应运而生了。
其实，严格来说，菌种就不可能定量。如果不信，请听听定量菌种的自白。
01
定量菌种的
自白书
我是定量菌种，来自于国内外的商业机构。我的祖先来自于菌种保藏机构的标准菌种，通过商业机构的传代、大体积培养获得新鲜培养物加上不同的保护剂配方后冷冻干燥（先在超低温环境中快速冻结，再按一定程序，在真空度极高的环境中缓慢升温，升华水分，最后充入不活泼气体）而成不同浓度的产品。
在国外媒体上有一些公开的保护剂配方成分，大家可以参考一下。
通过这个配方，大家可以看出我其实具备了两种主要功能：保藏和即用。配方中定量的标准菌种细胞是通过流式细胞仪定量的。配方中的一些保护剂成分必须保证我在冷冻干燥及后续的保藏过程中抵抗外界的压力，达到标识的保藏时间。另一方面，保藏之初的菌种活性也必须保证。使用时加上复融液就要可以使用，而不需要再复壮。 我一般保存在2-8℃就可以了。相比较温度条件，冷冻干燥要求两个更重要的条件：真空、干燥（含水量2-3%为佳）。 不同商业机构的产品技术就体现在保护剂配方的优化和冷冻干燥的技术指标。面对一味地强调超低温保藏的供应商，你应该马上问问这些方面做的怎么样。 最后，我的产品规格有很多不同浓度，但是都是以X-XXCFU/Xml的形式标识。保藏之初是细胞定量，最后计数是通过固体培养基平板计数，过程中存在不少影响因素，最后只能得到一个浓度范围的产品。（关于计数的影响因素可以去看系列中的上一篇文章）
02 认识，因研究而深入定性向定量的转化，普通仪器即可从2020年开始，国内的药检机构展开了对定量菌种的研究工作。我们可以结合上文中的定量菌种自白，仔细聊聊以下的研究结果和结论。 文章通过将2种品牌的定量菌种和新鲜菌液涂布在三种存在营养差异的TSA平板上来考察不同菌液的活性。结论是即用型w菌液因为在其中两种培养基上数量存在明显差异，被认为活性低于新鲜菌液；即用型a菌液差异不明显，活性与新鲜菌液一致。 新鲜菌液经过冷冻干燥过程，必然对细菌存在一定程度的损伤。文章中指出“即用型菌株的活性较低，可能会导致培养基适用性和方法适用性试验时的回收率不能达到要求，在抑菌效力试验中有可能会高估药品的抑菌作用。”文章中选择了对冷冻干燥最为敏感的铜绿假单胞菌来说明情况。 根据文章结果发现，不同厂家的定量菌种制备技术（菌龄控制、冻干步骤、配方成分等）对这种损伤的控制程度存在差异，表现的结果与新鲜菌液比较会有不同。文章中建议：“如果选择使用即用型菌株，应进行充分的试验研究，以证明其在培养基上的生长能力能够与新鲜菌液保持一致。
”
结果：与工作菌株新鲜培养物比较，商业定量菌株中的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，这4种菌株中部分回收比值偏低，甚者不能达到0.5，而金黄色葡萄球菌则无明显区别。结论：商业定量菌株用于含抑菌成分的药品微生物计数法方法的建立时，应对其进行质量考察和风险评估。
文章中将铜绿假单胞菌冻干型菌悬液和新鲜型菌悬液分别涂布5种市售胰酪大豆胨琼脂培养基，从菌落数量、菌落平均直径及肉眼可见菌落出现时间进行比较分析。
结果表明，冻干型菌悬液在不同品牌TSA培养基上的生长数量呈现显著性差异，这一点和之前的研究结果没什么不同。而且冻干型菌悬液在TSA培养基上的菌落直径大于新鲜型菌悬液，肉眼可见菌落出现时间也短于新鲜型菌悬液。
研究作者认为，这主要由于冻干型菌种在生产过程中所受冷冻伤害后以正常未损伤菌、损伤菌、死亡菌3种形式存在，活力上不均一。变化的重点是损伤菌的修复，而修复情况随不同TSA培养基而异。而新鲜菌悬液则以未损伤的营养体为主，活力好而且均一。
研究作者认为，冻干菌株作为一种菌种损伤模型，冻干型菌悬液更接近于微生物在待测样品的存活状态，更能灵敏识别培养基营养质量的差异。 综合这些年的研究可以发现，定量菌种其实是一种“方便”产品，优势明显，也确实和新鲜培养物存在差距。最新的认识是“不行”的定量菌种恰恰就是验证中的相对差的情况，更适合验证的使用。 更多观点，欢迎留言！！！
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