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撰稿 | 石决明
来自 | 蒲公英Ouryao
在日常的微生物实验中，我们会遇到很多微生物液体培养的情况，比如无菌检查的结果和微生物限度检查过程中的促生长实验（药典截图见图1和图2）。
“澄清”或者“浑浊”就是无菌检查结果的定性判断方式。而促生长实验中虽然引入了对照培养基的比较，但是结果也仅是“生长良好”。延伸来说，浓度的深浅就是微生物液体培养的定性判断方式。这时候就需要你用你的眼睛好好看看，区分出是否良好了。
01无菌对照培养基，想说用你不容易
《中国药典》2020年版通则9202非无菌产品微生物限度检查指导原则中指出：“对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。”不过通则1101无菌检查中并没有提及无菌检查用对照培养基的使用。判断标准是“加菌的培养基管均生长良好”。 “良好”是一个模糊的程度判断，听起来就像是微生物界的“还行”。在这里，我们可能会遇到以下三种情况： a) 对照和试验培养基一样浑浊（一样生长良好），这种情况概率较小 b) 对照比试验培养基浑浊（试验培养基生长不算良好），这种情况可以排除一部分营养差的试验培养基 c) 对照没有试验培养基浑浊（试验培养基生长优秀）。 如果强制规定无菌对照培养基的使用，首先受到影响的是培养基的厂商。培养基出厂的时候估计要在COA中增加与对照培养基的比较了（如果已经有厂商这么做了，请一定文后留言给大家看看）。而且微生物液体培养是十分复杂的体系，影响因素有很多： 1.培养基体系：营养物质（天然还是全合成）、水分、pH值等； 2.温度（会有空气浴和水浴的差别，一般认为水浴效果最好，大型发酵容器还会有内部加热）； 3.氧气（有一个重要的概念：溶解氧，就是在培养过程中溶解在培养基液体中的氧气。为了提高溶解氧，发酵罐中会有搅拌杆；在一般试管或者摇瓶的培养中是振荡培养）。 而现在药品微生物的培养中培养基成分几乎都是全合成的、采用空气浴加热和静置培养，对照上面的影响因素都不是最佳条件。
那“良好”到底谁说了算呢？其实，这就暴露出一个需求：浑浊度转化为数据，像微生物限度培养基一样用回收率范围来判定，更直观明确。这就是比浊法的用武之地。 02定性向定量的转化，普通仪器即可定性向定量的转化，普通仪器即可比浊法是一种间接估计液体浓度的方法，用实验室比较常见的紫外分光光度计即可。微生物培养物也是浑浊的：它们吸收一些光，然后让其余的光通过。细胞浓度越高，浊度越高，透光率就越低。 在微生物领域，麦氏浊度标准McF(McFarland)有更普遍的应用。原理是相通的，转化关系见下图。
从表格中可以看出麦氏浊度0.5-4就是透光率（600nm）下的74.3%-21.5%，接近于最佳测试范围(0.8-0.2)。但是必须明确液体浊度的测量是比较粗略的估计不够准确。然而如果前后测量的条件尽量一致，可以看出浊度的变化。
03生长曲线微生物的「成长日记」定性向定量的转化，普通仪器即可如果将浊度变化和时间的关系做成一张图，我们可以得到一个微生物发酵领域耳熟能详的的概念——“生长曲线”，如下图。 将少量纯培养微生物接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看到生长曲线的四个阶段：开始有一短暂时间（延迟期），细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快（指数期），既而细菌数又趋稳定（稳定期），最后逐渐下降（衰亡期）。 在发酵领域，生长曲线就像是那个总是能给你惊喜的魔术师。通过提供合适的培养条件（增加新鲜培养基、去除生长废物、提高溶解氧等等），我们可以延长指数期，让微生物的“青春”更长久。 稳定期时，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等,整个培养物中二者处于动态平衡。如果可以将这个过程维持数小时，这不是天生定量吗？也可以说是在稳定期内的定量菌种。 但是，别忘了，无论是液体培养的定性还是定量，都不是那么精确的判断。相比之下，固体培养基平板的计数就像是那个总是说实话的孩子，它更准确一些。我们下周将继续探讨这个话题。 互动问题： 你愿意为「生长良好」加上一个浊度的数字吗？ 更多观点，欢迎留言！！！
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