【镁伽杯】病毒纯化方式选择

药童12

病毒载体工艺流程图

下游层析仍然是剔除杂质最重要的步骤，大部分的病毒载体的下游工艺路线中都会涉及到两步层析，才能达到所需要的质量要求。每种病毒在层析技术的选择上，都有不同点。在选择层析工艺时肯定是从病毒的分子特点出发，就像做重组蛋白一样，病毒有那些特点能够让我们利用去选择合适的层析技术，主要有以下几个特点。

一个是它的基本的生物学特点，一些基本的大小、电荷和疏水性等，根据这些特点就可以选择不同类型的层析技术，比如根据大小可以看到病毒纯化非常经典的工艺路线中常常用到分子筛，主要就是利用了病毒跟杂质之间大小上的差异来区分。根据病毒的电荷性质，大部分的病毒它的表面携带负电荷情况比较多，根据电荷特点可以选择合适的离子交换的填料去做纯化。疏水性方面利用的少一点，因为疏水层析这项技术特点是高盐高盐上样和低盐洗脱，对于一个活的病毒来讲，很难去耐受一个高盐的条件，会影响病毒的稳定性，疏水层析可能会是最后一个选择。还有就是依据病毒的生物学特点，有一些合适的新和填料，有一些蛋白做成亲和填料，去特异性的捕获病毒，可以利用亲和层析纯化病毒的情况也是比较少的。大部分的亲和层析很难达到有效的洗脱，所以就限制了亲和层析的应用。另外一个方面就是病毒的稳定性，在工艺开发的前期先纯化一些病毒去做稳定性研究，与病毒稳定性有关的方面，浓度、pH、盐浓度、温度、稳定剂、剪切力等。综合判断病毒本身需要什么条件，这样可以在层析技术中去有意的屏蔽掉一些对病毒有损伤的条件。例如有些病毒不耐受高盐，那可能离子交换层析就不能应用。还有如果病毒对温度非常敏感，可能早期我们在做工艺开发时尽量低操作等等。可以根据病毒稳定性的注意事项去在我们的工艺开发中尽量去避免，维持病毒的活性。

病毒层析的传统工艺与新工艺，在传统的工艺路线当中层析会使用到阴离子和分子筛，新工艺捕获步骤仍然保持了阴离子，但是阴离子是做了一个填料上的一个升级，每次填料的升级都是可以提高载量提高生产效率的，在精纯的步骤，使了多膜式填料去替代传统的分子筛，不同的工艺路线并不是一点优势没有，或都说新的工艺一点缺陷也没有，需要辨证的去看不同的工艺路线。在做离子交接这一步时，以后的工艺可能不能得到一个最优的结果同，因为它处在第一步，既然是一个捕获步骤载量就是一个至关重要的考察点，所以要注意填料的筛选，同时摸索相应的条件的氯化钠溶液浓度对结果的优化非常重要。


对于病毒的精细纯化，这一步主要还是考察纯度，把杂质都要在这一步去掉，分辨率很重要，病毒跟蛋白相比分子量差异比较大，在病毒的精纯中像4FF/6FF这种分子筛非常的常用。CaptoTM  复合模式层析介质core700/400的原理在于同时有吸附性层析原理，是一种多种作用模式多种作用力来纯化的填料。与分子筛相比首先填料结构上有不同，填料颗粒分为两部分，外面有多性层，上面有小孔，病毒的大小远远大于它，无法进行到填料内部，而小分子的杂质会进入被填料里面的配基吸附住。它的优势就是不用把柱子装的很高。从流速上比分子筛快很多。分子筛常用的工艺流速是30-60cm/h，因为它装的很高，工艺流速慢，而core的工艺流速一般建议是200-300cm/h。所以说从分子筛到复合膜式填料的转化是可以大大提高生产效率的。从上料体积上分子筛一般会控制的比较低，约30%柱体积，做病毒在10%以下，而core700的上料体积取决于样品中杂质的含量，最高可达30CV（adenovirus），所以说从载量上来讲也比分子筛要高很多。分子筛也有core填料做不到的地方，就是做缓冲液的置换，有时把分子筛放在精纯步骤，不仅起纯化的作用还可以把病毒的样品直接置换到最后的制剂buffer中去。省去后面超滤换液操作。Core是达不到这种效果的。

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蒲公英征文组

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