水中总大肠菌群的测定延迟培养法

物生物

延迟培养法可以允许水样经滤膜过滤后，将滤膜装运、输送到实验室，进行培养并完成检验。在常规的检验步骤不能实现时，例如在水样运输的途中不能保证所要求的温度，或者在采样后不能在允许的时间内进行检验等都可应用延迟培养。

延迟培养法和标准的滤膜法比较表明两者的数据可以相符。延迟培养试验基本上是依照检验总大肠菌群的滤膜法进行修正而来的。此法是将水样在现场过滤后，将滤膜置于培养基上，然后运到实验室。这种运送滤膜的培养基能在运输过程中保持大肠菌群细菌的活性，但又不允许它们在运输到实验室的途中长成可见的菌落。

延迟培养试验两种可选择的方法是M-远腾氏法和LES法。

1．培养基

(1) M-远腾氏法

OM-远腾氏培养基。

OM-远腾氏防腐培养基：按M-远腾氏培养基配制，每升再加3.84g苯甲酸钠。另外，要根据水样情况来决定是否把环己亚胺加到M-远藤氏防腐培养基中。如己发现有蔓生霉菌或真菌的水样，按每100m1M-远藤氏防腐培养基加入50mg环己亚胺。

(2) LES法

①LES-MF保存性培养基。

② LES远藤氏琼脂培养基。

2．步骤

(1)采样前的准备

①过滤装置：以无菌操作把滤器装置装好。

②水样量的选择：待过滤水样量是根据所预测的细菌密度而定的，对总大肠菌群做滤膜试验应过滤水样的参考体积。一个理想的水样体积，可以产生大约50个大肠菌群细菌菌落，而全部类别的菌落数则不超过200个。当过滤水样（稀释的、或未稀释的）体积少于20m1时，应在过滤之前加少量的无菌稀释水到过滤漏斗中，以便水量的增加有助于悬浮的细菌均匀分布在整个过滤表面。

③过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。

④培养皿：无菌的、密封保湿的塑料培养皿50mm×12mm。这种培养皿重量轻，不易破碎。紧急情况下，也可使用无菌的玻璃培养皿，但要用塑料薄膜或类似的材料包装起来。

(2）水样的保存和运输

①用灭菌镊子把一片灭菌吸收垫放在一个灭菌的培养皿底部，并吸收足够的、己选择好的，在运输过程中可抑制大肠杆菌生长的运输培养基（如M-远腾氏防腐培养基或LES-MF保存性培养基），使垫片浸湿饱和（小心地吸去剩余培养基）。

②用灭菌镊子从过滤设备上取下滤膜，放在已用运输培养基饱和过的吸收垫上。紧闭塑料培养皿就能保持高湿度，防止滤膜损失水分。注意运输途中不使滤膜脱水，但也不要使皿中有过多的液体。把放置有滤膜的培养皿放在适当的容器里送到实验室去做试验。运输时，样品可在此种培养基上保持72h而无明显生长。这种运输培养基可邮递或普通方法运送。当遇到高温时，偶然能在运输培养基上发现有菌落生长。

(3）转移和培养

在实验室里，以无菌操作把滤膜从运输用的塑料培养基皿上移到含有M-远滕氏培养基或LES-远滕氏琼脂培养基的第二个无菌的平皿中。

①M-远腾氏方法：从M-远腾氏防腐培养基上把滤膜转移到含有没有抑菌剂的M-远腾氏培养基的吸收垫平皿中，在37℃±1℃培养20-22h。

②ES法：把滤膜从LES-MF保存性培养基转移到LES-远腾氏琼脂培养基里，在37℃±1℃培养20^22h.在转移时，如果不用放大镜已可观察到清晰的菌落，则在放进37℃±1℃的温度培养16-18h之前，将含有转移滤膜的培养皿先存放在5-10℃处。缩短培养时间是为检验员提供一种控制细菌生长过度或菌落光泽消散的办法，以免影响对大肠菌群的菌落计数。

3．总大肠菌群数的估算

挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。

紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。

凡系革兰氏阴性无芽孢杆菌，需再接种于乳糖蛋白陈培养液或乳糖蛋白膝半固体培养基（接种前应将此培养基放入水浴中煮沸排气，冷却凝固后方能使用），经37℃培养，前者于24h产酸产气；或后者经6-8h培养后产气，则判为总大肠菌群阳性。计数滤膜上生长的大肠菌群菌落总数，根据过滤的水样量计算1L水样中总大肠菌群数。

总大肠菌群数（个／L)= 滤膜上生长的大肠杆菌菌落数×1000/过滤水样量（ml)

滤膜上菌落数以20-60个/片较为适宜。

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