对比2015版药典四部-无菌检查法（2020版药典四部删除部分），2020版药典四部-无菌检查法（2020版药典四部增加部分）
无菌检查的定义及无菌检查的适用条件
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供拭品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验需对试验环境进行监控测。
培养基
培养基的制备及培养条件
培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基商品化的预制培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2-25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若
保存于密闭容器中，一般可在一年内使用下保存，并在经验证的保存期内使用。
1 硫乙醇酸盐流体培养基
胰酪胨 1.50g 氯化钠 2.5g
酵母浸出粉 5.0g 新配制的0.1% 刃天
葡萄糖/无水葡萄糖5.5g/5.0g 刃天青溶液 1.0ml
L-胱氨酸 0.5g 琼脂 0.75g
硫乙醇酸钠 0.5g 水 1000ml
(或硫乙醇酸） （0.3ml）
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 PH为弱碱性，煮沸，滤清，加人葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节PH, 使灭菌后在25℃ 的PH值为7.1土0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/3 1/5,否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30-35℃培养。
2 胰酪大豆胨液体培养基
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3中和或灭活用培养基
按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌前或使用前加人适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。
4 0.5 %葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）
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5 胰酪大豆胨琼脂培养基
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6 沙氏葡萄糖液体培养基
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7沙氏葡萄糖琼脂培养基
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8马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)
马铃薯（去皮） 200g 琼脂 14.0g
葡萄糖 20.0g 水 1000ml
取马铃薯，切成小块，加水1000ml，煮沸 20-30分钟，用6-8层纱布过滤，取滤液补水至1000ml，调节 PH使灭菌后在25℃的PH值为5.6±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加人葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
培养基的适用性检查
无菌性检查
每批培养基一般随机取不少5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。
灵敏度检查
菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认，以保证试验菌株的生物学特性。
除上述内容外其他内容无变化。
菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基
中，30-35℃培养18-2 4小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20-25℃培养24-48小时2-3天，上述培养物用PH7.0无菌氯化
钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数每小1ml于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液适宜浓度菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或马铃
薯葡萄糖琼脂培养基上，20-25℃培养5-7天或直到获得丰富的孢子，加入3-5ml适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%(ml/ml)聚山梨酯
80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的 PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%
(ml/ml)聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液制成1ml含菌数小于100cfu适宜浓度的孢子悬液。
菌悬液若在室温下放置，一般应在2 小时内使用；若保存在2-8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
培养基接种 取每管装量为12ml适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照,培
养3天；取每管装量为9ml适宜装量的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5
天。逐日观察结果。接种细菌的培养管培养时间不超过3天，接种真菌的培养管培养时间不得超过5 天。
结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
稀释液、冲洗液及其制备方法
稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1. 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清必要时滤过使澄清，调节pH值至7.1士0.2，分装，灭菌。
2. pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g， 加水1000ml，微温溶解，滤清必要时滤过使澄清，分装，灭菌。
根据供试品的特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液或冲洗液（如0.9% 无菌氯化钠溶液）。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
方法适用性试验
菌种及菌液制备
除大肠埃希菌 （Esherichia coli) 〔CMCC（B）44102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查。大肠埃
希菌 （Esherichia coli) 〔CMCC（B）44102〕的菌液制备同金黄色葡萄球菌。
薄膜过滤法
按供试品的无菌检查要求，取每种培养基规定接种的供试品总量，采用薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于不大于100cfu的试验菌，过滤。加硫乙醇盐酸盐流
体培养基或胰酪大豆胨液体培养基培养基至滤筒内，接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢 梭菌的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基；接种枯草芽孢杆菌 、白色念珠菌、黑曲霉的
滤筒内加胰酪大豆胨液体培养基 。另取一装有同体积培养基的容器，加人等量试验菌，作为对照。置规定温度培养，培养时间不得超过5天，各试验菌同法操作。
直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基 6 管，分别接入小于不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各 2 管；
取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接人小于不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。
其中1管按供试品的无菌检查要求，接人每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5 天。
结果判断
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供试品的无菌检查
检验数量
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检验量
是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。除另有规定外，供试品检验量按表3规定。若每支(瓶)供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤内容物全部过滤。
阳性对照
应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；
抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；
抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。
阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于不大于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量
。
阳性对照管培养72小时内不超过5天，应生长良好。
阴性对照
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供试品处理及接种培养基
操作时，用适宜的消毒液方法对供试品容器表面进行彻底消毒 ，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导人无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。
除另有规定外，按下列方法进行供试品处理及接种培养基。
1.薄膜过滤法
薄膜过滤法一般应釆用封闭式薄膜过滤器，根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm，。滤膜直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。若使用其他尺寸的滤膜 ，应对稀释液和冲洗液体积进行调整，并重新验证。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前，一般应先将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。
油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗童一般不超过1000ml500ml，最高不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
水溶液供试品水溶性液体供试品
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水溶性固体和半固体供试
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非水溶性供试品
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可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品
取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但加热温度一般不超过40°C，最高不得超过44°C，趁热迅速过滤。
对仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加人不少于100ml的适宜稀释液，充分振摇萃取，静置 ，取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
无菌气雾剂供试品
取规定量，采用专用设备将供试品转移至封闭式薄膜过滤器中。或将各容器置－20°C或其他适宜温度冷冻约1小时，取出，以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再
无菌开启容器，并将供试品转移至无菌容器中混合，迅速消毒供试品开启部位或阀门，正置容器，用无菌钢锥或针样设备以无菌操作迅速在与容器阀门结构相匹配的适宜位置钻一
小孔，不同容器钻孔大小和深度应保持基本一致，钻孔后应无明显抛射剂拋出，轻轻转动容器，使拋射剂缓缓释出，释放拋射剂后再无菌开启容器，并将供试液转移至无菌容器中
混合，必要时用冲洗液冲洗容器内壁。供试品亦可采用其他适宜的方法取出。然后照水溶性液体供试品或非水溶性供试品项下的方法操作。
装有药物的注射器供试品
取规定量，将注射器中的内容物(若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解）直接过滤，或混合至含适宜稀释液的无菌容器中，然后照水溶液水溶性液体或非水溶性供试品项下方
法操作。同时应采用适宜的方法对包装中所配带的针头等要求无菌的部件进行包装中所配带的针头的无菌检查。
具有导管的医疗器械（输血、输液袋等）供试品
除另有规定外，取规定量，每 个最小包装用适量的（通常50-100ml) 冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液水溶性液体供试品项下方法操作。同时应采用
适宜的方法对进行包装中所配带的针头的等要求无菌的部件进行无菌检查。
2.直接接种法
混悬液等非澄清水溶性液体供试品
固体供试品 取规定量，直接等量接种至各管培养基中，或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量等量接种至各管培养基中。
非水溶性供试品
敷料供试品
肠线、缝合线等供试品
灭菌医用器械供试品
放射性药品
以上七个项目除固体供试品外，其他项目2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容无变化。
培养及观察
将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养不少于14天；接种生物制品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30- 35°C培养，一份置20-25°C培养。培养期间应定期观察并记录是否有菌生长。
如在加人供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量不少于1ml转种至同种新鲜培养基中，将原始培养物和
新接种的培养基继续培养3不少于4天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。
结果判断
阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。
若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。
当只有符合下列至少一个条件时方可认为试验无效：
(1) 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。
(2) 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。
(3) 在阴性对照中观察到微生物生长。
(4) 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
试验若经评估确认无效后，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。
表1 批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量
2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容相比，只有“医疗器具”改为“医疗器械，其他无改动；
表2 上市抽验样品的最少检验数量
2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容相比，只有“医疗器具”改为“医疗器械”，其他无改动；
表3 供试品的最少检验量
2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容相比，“医疗器具”改为“医疗器械”、“其他医疗器具”改为“其他医疗器械”；液体制剂一行， 供试品装量一栏，V≤1ml 修订为V<1ml；固体制剂一行，供试品装量一栏，M≥5g 修订为 M>5g，固体制剂一行，每支供试品接入每种培养基的最少量一栏，从上数第二行“半量”后增加“但不得少于50mg”。
2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容相比
术语的表述更加准确，如“水溶液供试品”修订为“水溶性液体供试品”、“医疗器具”修订为“医疗器械”等。
数字范围的表述更严谨，如“小于”修订为“不大于”，具体时间如“培养14天”修订为“培养不少于14天”等的运用。
贴合实际操作增加了部分内容，如培养基增加了“8马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)”。
强化了标准的通用性，如薄膜过滤法一般应釆用封闭式薄膜过滤器，根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm，。滤膜直径约为
50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。若使用其他尺寸的滤膜 ，应对稀释液和冲洗液体积进行调整，并重新验证。
使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性；供试品处理及接种培养基 操作时，用适宜的消毒液方法对供试品容器表面进行彻底消毒等； 培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基商品化的预制培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2-25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用下保存，并在经验证的保存期内使用。
总之2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容相比 ，无菌检查法的通用性，严谨性、准确性大大增强了。
针对上述变化，在2020年12月30日之前，要完善有关无菌操作的SOP，要对一些时间参数进行确认，如 菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认，--------
认真研读2020版药典四部通则1101-无菌检查法，找出变化点，结合无菌检查的操作实际，及早完善相关标准及操作，才能使无菌控制过程及控制结果符合2020版药典四部通则1101-无菌检查法的要求。
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发表于 2020-8-2 11:45:38
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