【知药学社】腺病毒载体规模化制备与纯化要点分析

imqk

编者按：本文为知药学社社员刘波在知药学社社群分享的课程，知药学社将进一步加大对生物制品、无菌制剂等方面的内容分享，有相关课题分享意愿的老师可直接联系我，公益分享传播知识同时，通过知药学社平台可以让更多人认识你，关注你们公司产品，实现多赢。

本文分享者：刘 波     来 源：知药学社

一、腺病毒载体的历史背景及发展近况

基因治疗名词解释：通过载体将正常的基因导入到有基因缺陷的细胞里，使细胞恢复到正常状态，从而达到治疗疾病的目的。

基因治疗作为一种治疗疑难疾病的医疗手段，自上世纪80年代问世以来，不断发展至今，逐渐受到人们的重视和青睐，近两年更是频频进入大家的视野。

用于基因治疗的载体可分为病毒载体与非病毒载体。病毒载体中，最为常用的有腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体等等。下面给大家介绍的就是腺病毒载体。

我国目前已上市的腺病毒载体药物有两种：

1、今又生－重组人P53腺病毒注射液（深圳赛百诺）
2、安柯瑞－重组人5型腺病毒注射液（上海三维）

CDE网站上临床试验中腺病毒载体新药：

二、腺病毒载体的获得及培养

1、腺病毒载体的获得方式：

2、腺病毒的培养

I、小、中规模培养

培养要点：细胞培养时的良好的细胞状态固然重要，但两者更需要把握的关键还有染毒前的细胞均匀度与汇合度。均匀铺展的85%~90%汇合率细胞，能很好提高病毒产率。

II、大规模培养

生物反应器培养方式适用于生产规模，可分为以下三种：

（1）贴壁培养  

该培养方式目前仍属于主流。但这种方式需要使用血清，在未来几年可能会受到药监部门政策的限制，腺病毒的生产将不允许添加血清，所以行业都在向无血清培养方式转变。

生物反应器贴壁培养要点：

①细胞培养阶段

填充物用量：填充体积一般占反应器总体积的25%~40%
细胞接种量： 1~2E4 Cell/cm2

搅拌桨转速： 60rpm~130rpm
溶氧： 30%-60%
pH： 7.20~7.40

培养基置换：以培养基中葡萄糖浓度为监控指标， 流加培养基使用葡萄糖浓度维持在0.5~2g/L，培养后期可降低血清浓度。

完成培养指标：根据糖耗推算细胞数，达到填充物面积的85~90%汇合率时，完成细胞培养，可接种腺病毒。

②病毒培养阶段
病毒接种量：过多导致细胞死亡过快， 过少则影响病毒收获时期

培养基置换：接毒前应将反应器内培养基全部置换，将降低血清浓度。接毒后4~7小时才可流加，补充营养与避免毒种流失。

上清病毒收获：每日监测培养上清中病毒含量，出毒后即收获病毒上清。准备收获病毒上清前，可将流加培养基中的血清浓度降到0%
以降低后续纯化工序的负担。

胞内病毒收获：培养基中葡萄糖消耗量下降到30-40%，即可终止培养，裂解细胞释放病毒

（2）悬浮培养方式

病毒培养阶段

病毒接种量：与贴壁培养同理，但可以适当提高病毒接种量。

培养基补加：与贴壁培养不同，不能将反应器内培养基全部置换，接毒后需立即补加一定量的培养基维持营养，待病毒完成感染后再开始进行流加置换培养基；若在细胞培养阶段是用的批次流加，则病毒培养阶段仍采用此策略。

病毒收获：一般在感染病毒48-72小时后即可终止培养，收获细胞并裂解释放病毒；若培养上清中病毒含量较多，也可将上清收集一同送入纯化工序。

（3）贴壁培养+悬浮培养

三、腺病毒纯化

I、病毒纯化之样品前处理

1、目的：去除样品中的大颗粒及小分子杂质，并将样品浓缩并置换到层析缓冲液相近的条件。

2、方法：大颗粒杂质主要是宿主细胞碎片，可用离心和过滤的方法去除。小分子杂质主要是宿主细胞的DNA及蛋白质，可先用核酸酶将DNA消化，再用超滤的方法将其滤除。样品浓缩和置换缓冲液在超滤时同步进行。

3、样品前处理要点：

去除大颗粒杂质时，过高速离心或超压过滤时，会造成病毒损失，要控制好离心转速并且匹配好料液与滤膜面积的关系。

去除小分子杂质时，要注意超滤膜孔径（分子量）的选择，分子量过小导致杂质去除率低；分子量过大导致病毒损失。一般选择病毒直径1/3左右的膜孔径。超滤操作过程中还需要控制好进样压力和液流中气泡，避免损伤病毒的附属器导致病毒失活。

浓缩及置换缓冲液时，因液体湍流作用会再次产生一些肉眼可见的杂质，应在上层析柱前离心或过滤去除

II、病毒纯化之柱层析

1、通常采用两步层析法可获得高纯度的腺病毒

强阴离子凝胶（Q sepharose XL）+高分辨阴离子凝胶（source 30Q）
强阴离子凝胶（Q sepharose XL）+分子筛凝胶（Sepharose 4 FF）
强阴离子凝胶（Q sepharose HP）+复合型凝胶（ Capto core 700 ）

2、柱层析要点

上样量：不同层析填料、不同的样品处理，会有不同的特异性载量，通过小试积累数据评估出特异性载量，再进行放大。

上样流速：控制流速，使病毒样品在层析填料中保留15分钟以上。
起始盐浓度：适当提高样品及平衡缓冲液的盐浓度，可提高收率、缩短时间。

层析填料清洗：常规的再生方法并不能很好地清除杂质残留，累积至一定量时会影响纯化效率，需要用变性剂对填料进行彻底清洗。

III、病毒纯化之浓缩与置换

1、目的：提高病毒浓度、降低盐浓度

2、方法：用超滤方法将病毒浓缩至预期的浓度。通过10倍-20倍超滤置换，将病毒置换到最终制剂缓冲液中。

3、病毒浓度：过高的浓度容易导致病毒聚集成团，不可过度浓缩。

4、超滤膜分子量（孔径）的选择：可选择更小孔径的超滤膜提高病毒回收率。超滤操作过程中还需要控制好进样压力和液流中气泡，避免损伤病毒的附属器导致病毒失活。

问  与  答

Q：无血清培养效果如何，能完全代替血清吗?后期维持液是在什么时候换成无牛血清培养基？残牛含量能控制到什么水平？

A：如果是贴壁的培养方式，在细胞培养阶段是不能够完全用没有血清的培养基去培养，只是可以降低培养基的浓度，比如从10%降到2%。如果是无血清悬浮培养的方式，就现在我们用的，筛选出有好几种国产的无血清培养基，培养的效果都是比较好的。如果是贴壁培养，前期用的是含血清培养，然后再接毒的时候换成不含血清的培养基，在后期产品血清残留可以控制到几个纳克每毫升。

Q：酶切的方法现在是否是允许的？

A：酶切的方法现在是允许的。根据中检院老师发布的一些生物制品的控制原则，里面是可以用酶来生产，但在后期需增加酶残留量的检测。

Q：连续灌流现在做到多大规模？

A：如果是无血清悬浮培养，国内水平基本的都是WAVE反应器，几升到上百升的规模，国外水平会比较高一些。

Q：生物制品的复杂性决定了其制备的不确定性，纯化后目标物质有时浓度不够，有时浓度会很高，工艺上是规定再浓缩还是不再浓缩？不规定，浓度不够时再浓缩，可能会导致发生在长生身上的问题，这个在做工艺时如何去规定？

A：这个问题，我们处理方式是从精纯这步开始解决。在粗纯后测定产物浓度，再上精纯，出来的产物浓度就可以控制在一定范围之内，后续工艺全部都写需要浓缩。

syhorchid

谢谢分享

大可1980

感谢楼主分享

wwk2582

谢谢分享！

wflyxm

谢谢分享

yly5201

谢谢楼主分享

dodowell

谢谢分享~

是老王呀

感谢分享！