外源DNA残留量检测的疑惑

hangzhouhdjy

我们的总DNA是从E.coli中提取的，A260/A280=2.01，片段大小为700bp。样品为原液，其外源DNA残留量标准为<1ng/mg（即每1mg蛋白质中DNA含量小于1ng）
我们使用的是Roche的DIG High Prime DNA Labeling And Detection Starter Kit I（地高辛标记检测试剂盒），将提取到的总DNA用DNA稀释液（Roche试剂盒内提供）稀释至1ng/μl，根据2015版中国药典的要求制作成DNA含量分别为10ng、1ng、100pg这三个梯度（阳性对照品），DNA稀释液作为阴性对照。DNA含量越高，用地高辛标记后显示的颜色就越深，样品的颜色小于阳性对照1ng的颜色即为合格。
实验方法如下：①阳性对照、阴性对照、样品一起在沸水浴中变性10min以解开DNA的双链；10min后迅速将三者转移至冰水浴中维持5min（快速地由热转冷是确保解开的双链不再恢复，缓慢冷却是会恢复的）；②5min后取出用8000r/min离心30s（样品中的蛋白质会因为极热极冷后析出，离心后获得上清液）；③将三者分别添加到带正电荷+的杂交膜上（Roche的杂交膜）后抽滤使得DNA缓冲液离开杂交膜而DNA留在杂交膜上；④抽滤后将杂交膜正面朝上（膜上有阳性对照、阴性对照、样品）放在干净的玻璃平皿内并转移至120℃的电热恒温培养箱中加热30min（DNA固定）；⑤30min后取出杂交膜放到杂交袋内（Roche的杂交袋）后加入预杂交液使得杂交膜完全浸泡在里面，尽量排净杂交袋内的预杂交液和杂交膜之间的气泡并对杂交袋封口，封口后转移至40℃的恒温水浴锅内预杂交1h（预杂交液在浸泡杂交膜之前要先预热至40℃）；⑥1h后将对应的探针在沸水浴中变性5min以解开DNA的双链，5min后迅速将三者转移至冰水浴中维持5min（快速地由热转冷是确保解开的双链不再恢复，缓慢冷却是会恢复的），冷却结束后取出水浴锅内的杂交袋，弃去袋内的预杂交液并把杂交膜转移至新的杂交袋中，加入新的预热好的预杂交液和冷却好的探针，混匀后尽量排净杂交袋内的杂交液和杂交膜之间的气泡并对杂交袋封口，封口后转移至40℃的恒温水浴锅内杂交过夜。（探针浓度为25ng/ml，即探针在预杂交液中的含量，探针的来源是上面提到的总DNA经过扩增得到的，扩增液由Roche试剂盒内提供）。
杂交过夜后，从水浴锅内取出杂交袋，弃去杂交液留下杂交膜，将膜转移至干净的玻璃平皿内，加入洗涤液进行合适的条件下进行洗涤→封闭→加抗体→显色。
洗涤液1：20%SDS溶液 50μl+20X SSC溶液1ml+8.95ml超纯水=10ml
洗涤液2：20%SDS溶液 50μl+20X SSC溶液250μl+9.7ml超纯水=10ml
洗涤液3：30μl吐温20+10ml马来酸缓冲液=10ml
封闭溶液：1ml封闭液+9ml马来酸缓冲液=10ml（封闭液由Roche试剂盒内提供）
抗体溶液：1ml封闭液+9ml马来酸缓冲液+2μl抗体=10ml（抗体由Roche试剂盒内提供）
显色溶液：200μl显色液+9.8ml检测缓冲液=10ml（显色剂由Roche试剂盒内提供）
先用洗涤液1洗膜两次，每次5min（室温下）；再用洗涤液2洗膜两次，每次15min（65℃下）；接着用洗涤3洗膜一次，5min（室温下）；封闭液洗膜一次，30min（室温下）；抗体溶液洗膜一次，30min（室温下）；又用洗涤液3洗涤两次，每次15min（室温下）；检测缓冲液平衡一次，5min（室温下）；最后用显色溶液进行显色16h（静置避光、室温下）。
整个洗涤的过程中都用到摇床，确保杂交膜在洗涤液内有序地转动。试剂盒内不提供的试剂均是自配，配方是根据试剂盒说明书执行。需要重复洗涤的步骤中洗涤液每次均新鲜配制。
问题如下：2015版药典提供的方法和Roche试剂盒说明书的做法有明显的区别，整个处理过程中的参数是否都必须严格执行药典的规定？个人认为，杂交的温度和时间应该是一个区间而不是固定值，满足条件下适当放宽是值得考虑的。另外，提取总DNA目前有许多的商品化试剂盒，同样和药典有较大出入，传统方法和创新方法如何作出取舍呢？药典的升级周期过长，即使周期到了，相关内容也不一定会修改（做相关实验的人少，提出意见不够多、不够全，以致药典起草委员会无法评估就维持原状）
拜请各位大牛为我解惑，感激不尽

herozxq

色谱微信群，加zorro_zheng，加时请提示制药

小猪吃你

淘大侠

使用罗氏的试剂盒只要你做过了完整的方法学验证是没有问题的。

tianyu0520

我们公司是按照试剂盒方法做的，需要做方法学验证。

质管-小伟

请问，你们是通过测定总DNA残留量来证明外源性DNA残留量，这样符合要求吗？提取的总DNA，是否一定包含外源性DNA呢？

小金库

非常给力的资料,多谢分享

胖剩儿1

我们用的是默克的杂交膜，感觉效果不是很好，可否提供下Roche杂交膜和杂交袋的货号？感谢