小奕说药 | 非对称构型双抗的同源二聚体分析

奕安济世生物药

双特异性抗体（简称双抗；Bispecific Antibody，BsAb），是通过重组DNA或细胞融合等生物技术制备的人工抗体，可以同时或先后特异性结合两种靶抗原或同一靶抗原的两个不同表位。与单抗相比，双抗具有更强的特异性、更好的疗效和低治疗成本（相较于单抗组合疗法）等潜在优势。

双抗概念的提出最早可追溯到20世纪60年代，但从理念的提出到转化为上市药物经历了漫长的时间。全球第一款双抗药物Catumaxomab（Removab®）于2009年获得欧洲药监局（EMEA）批准上市，用于治疗标准疗法无效的EpCAM阳性癌患者的恶性腹水。据统计，截止到2024年11月，全球已获批过17款双抗药物，绝大部分的构型为非对称型，简要信息见表1。

表1. 全球上市双抗药物信息汇总表（截止到2024年11月）

与传统概念的单抗分子不同，双特异性抗体在自然状态下并不存在，需要通过重组DNA或细胞融合技术人工制备实现。因此，双抗的分子结构设计是非常重要的，即双抗的分子构建技术平台是其技术核心之一。目前业内较常用的双抗技术平有BiTE、Triomab、DuoBody、DART、Nanobody和Crossmab等。

从表1可见，目前已上市双抗药物的分子结构以非对称型的异源二聚体为主，相比于对称结构的双抗，非对称型的异源二聚体双抗多具有天然的IgG或scFv结构和几何形状，因此具有相对较低的免疫原性风险。但是，非对称型双抗生产工艺中特有产生/残留的同源二聚体杂质对产品的生产工艺和质量控制也可能会造成巨大挑战。

同源二聚体的产生及其影响

非对称构型的双抗通常用同一细胞或不同细胞表达不同的轻链和重链，随后在胞内或胞外以正确配对的方式完成结构的组装。但是，生产过程中也可能导致错误组装的分子形成，例如具有单特异性的同源二聚体分子，一种情形的同源二聚体结构形成的示例见图1。同源二聚体可能有非预期活性，或者无活性，属于产品相关杂质/变体。此外，有些同源二聚体甚至可能会带来重大的安全风险（例如抗CD3单抗可能会引起脱靶效应引发不期望的免疫反应），因此在生产过程中有效去除和控制它们是生产工艺开发的重点。

图1. 杵臼结构（knob-in-hole, KIH）双抗的同源二聚体形成及结构示意图

在一些上市非对称构型的双抗已披露的审评资料信息里显示，同源二聚体被评估为关键质量属性（CQA）。例如，在Emicizumab的FDA质量审评报告中，关于原液活性成分评估的Q-Homo和J-Homo被认为是CQA，它们会影响产品的有效性和安全性（生物学活性、药代动力学、免疫原性以及非免疫原性安全性），并通过阳离子交换色谱法（CEX-HPLC）进行质量控制。再比如，在Amivantamab的EMA审评报告中，原液中的同源二聚体被认为是CQA并需要通过疏水作用色谱法（HIC）进行质量控制。

与其他产品相关杂质/变体如聚集体、片段等不同，通过下游纯化去除同源二聚体杂质可能具有挑战性，因为它们通常表现出与预期的双抗产物非常相近的理化性质。因此，选择合适的分析方法是监控生产工艺中同源二聚体水平的首要工作之一。

同源二聚体的分析方法

由于各研究机构使用了不同的双抗分子构建平台，不同双抗分子的序列及结构可能也存在较大差异，因此不同产品同源二聚体与异源二聚体的理化性质差异可能会有很大区别。这些差异可能是由于电荷、疏水性、分子大小或一些综合因素引起的，因此常可以通过基于电荷差异的分离分析方法（如离子交换色谱法）、基于疏水性差异的分离分析方法（如反相色谱法或疏水作用色谱法）、基于分子尺寸/分子量/质量电荷比差异的分离分析法（如SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳法、毛细管凝胶电泳法或质谱法）等技术进行分析检测；除此之外，还有基于混合模式的色谱分离分析法（如混合模式尺寸排阻色谱法）也有成功应用的案例。

DuoBody技术是具有IgG结构样式的非对称双抗分子构建常用的一种平台技术，其操作过程相对简单，仅需在两个IgG抗体Fc的CH3结构域分别引入氨基酸突变位点，在体外混合两个母体单抗并在氧化还原的环境下即可完成受控Fab臂交换（Controlled Fab-arm exchange, cFAE），形成异源二聚体目标双抗，如下图2所示。

图2. 采用受控Fab臂交换技术交换构建的Amivantamab示意图

Michael J Gramer等人报道了利用阳离子交换色谱法（CEX-HPLC）对使用受控Fab臂交换技术生产的双抗工艺中间样品中同源二聚体进行监控的方法（图3A），该方法对目标双抗分子及两种同源二聚体杂质的分离度良好，并且能有效监控工艺过程中的同源二聚体变化趋势。该方法相比于SDS-PAGE法（图3B）有显著的分离度优势。

图3. （A）利用阳离子交换色谱法（CEX-HPLC）监控受控Fab臂交换工艺过程中的同源二聚体；（B）相同工艺过程样品在SDS-PAGE上的分离情况

Glen Giese等人使用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）将采用杵臼结构（knob-in-hole, KIH）技术制备的双抗生产工艺中间样品进行分离，从图4分析色谱图可见，“杵-杵”同源二聚体（Knob dimer）和“臼-臼”同源二聚体（Hole dimer）均与目标双抗分子（BsAb）之间有一定的疏水性差异，因此彼此能有较好的反相色谱分离。

图4. 利用反相高校液相色谱法（RP-HPLC）监控杵臼结构双抗工艺生产过程中的同源二聚体

Desislava Yanakieva等人在研究使用受控Fab臂交换技术制备的双抗时，采用疏水作用色谱法（HIC）作为检测组装效率的分析手段。该研究选择的几种模式单抗分子通过受控Fab臂交换组装成的双抗分子，与其母体单抗均具有很好的色谱峰分离度（无论母体单抗的重链C端连接了VHH结构域与否），详情如图5所示。

图5. 利用疏水作用色谱法（HIC）分析受控Fab臂交换工艺制备的双抗组装效率（a、b、c三图中，各图中间的色谱峰均为目标双抗产物峰，两侧峰为母体单抗/同源二聚体）

此外，Sijia Huang等人在构建岩藻糖敲除的杵臼结构双抗分子MBS301（结构见图6左）时，也成功使用HIC分离分析出了目标双抗分子与其两个同源二聚体分子的色谱峰（图6右）。

图6. 利用疏水作用色谱法分析臼结构双抗MBS301（结构见左图）的同源二聚体（右图）

基于分子尺寸差异分离的电泳/色谱分析方法，对于分离具有等长（或近似等长）双链的非对称构型双抗及其同源二聚体杂质通常存在很大的困难，因为这类同源二聚体的分子尺寸理论上与目标双抗的分子尺寸非常接近，在当前基于分子尺寸差异分离原理的电泳或色谱分离技术水平下，还很难将它们进行有效分辨。如前文图3（B）的SDS-PAGE电泳图谱所示，目标产物双抗与其同源二聚体1/2的电泳条带虽然存在迁移距离的差异但并不明显（相比于CEX-HPLC的色谱保留时间差异），而同源二聚体1和2的电泳条带迁移距离几乎没有差异，这比CEX-HPLC的分辨率明显要低。与此类似地，Mingyan Cao等人在研究杵臼结构双抗的产品相关杂质时，在Lambda-Fab-Select亲和层析流穿液的非还原型CE-SDS图谱中观察到双抗A电泳峰的右肩存在“臼-臼”同源二聚体峰（见图7），但是彼此之间未达到有效的分离，因此在这个案例中使用CE-SDS也无法对同源二聚体进行有效的检测。

图7. 非还原型CE-SDS分离臼结构双抗的产品相关杂质

基于分子量/质荷比差异分离的高分辨质谱法也可用于分析具有等长（或近似等长）双链的非对称构型双抗及其同源二聚体杂质，但需满足双抗与其同源二聚体的分子量差异大于质谱仪的质量分辨率以及待分析分子的异质性较低等前提。前文所述的Michael J Gramer等人对使用受控Fab臂交换技术生产的双抗工艺中间样品的分析研究中，将待分析物切除N糖后使用ESI-TOF法（去糖完整分子量）能将目标双抗及其两个同源二聚体进行一定程度的分离，如图8所示。值得一提的是，文献中这种观察到的分离是基于两种同源二聚体和目标双抗样品分别去糖后独立进样实现的，而实际工艺不同的中间样品是这三种组分不同比例的混合物，在受到仪器分辨率限制、产物翻译后修饰复杂程度（即使已经脱去了N糖）以及各组分占比不同等因素的影响下，实际工艺中间样品中目标双抗和同源二聚体峰相互之间的分离度可能并不理想。

图8. 高分辨质谱法（去糖完整分子量）分离受控Fab臂交换技术生产的双抗及其同源二聚体（A左：同源二聚体1-蓝色质谱峰；A右：同源二聚体2-红色质谱峰；B：25L反应器制备产物中的目标双抗质谱峰）

除上述分离分析方法以外，还有文献报道了使用混合模式色谱对双抗及同源二聚体分析的案例。Haitao Jiang等人使用了混合模式SEC色谱柱与多角度光散射检测器（MALS）联用并结合液质联用等其他方法分析了一种杵臼结构双抗培养物上清中的目标双抗产物及其产品相关杂质，混合模式SEC色谱图如图9所示。从图9中的几种不同结构组分间的色谱峰分离情况及分子量-色谱保留时间关系推测，该混合模式色谱柱对双抗及其同源二聚体的分离作用依赖于分子排阻以外的作用原理，比如疏水作用，而决定组分与色谱填料作用强弱（组分洗脱顺序）的，是Lb轻链（红色轻链）在组分分子中的存在数量。因此，该案例本质上可以视作疏水作用色谱法分离分析的一种延伸。

图9. 混合模式SEC-HPLC分离杵臼结构双抗不同培养物上清中产物及其产品相关杂质（左图及右图代表了两种不同情形的培养物上清产物及杂质组成；红框中为同源二聚体结构，绿框中为目标双抗结构）

除上述基于理化分析技术的方法以外，还有研究采用基于生物学的分析方法检测双抗产品中的同源二聚体。Ho Young Lee等人在研究T 细胞依赖性双特异性抗体（T-cell-dependent bispecific antibodies, TDB）时，利用Jurkat报告基因细胞系开发了一种灵敏（可以检测到低至总蛋白0.5%水平的aCD3同源二聚体）且定量的T细胞活化检测方法，该方法可以利用其在没有靶细胞的情况下激活T细胞的能力来检测TDB药物产品中的 aCD3同源二聚体。其原理如图10所示，在没有靶细胞参与的情况下，TDB分子与效应细胞上TCR的单价相互作用不足以激活T细胞；相反地，二价的aCD3同源二聚体相互作用可有效使TCR二聚化，从而导致T细胞活化（图10 a、c）。因此，该检测能特异区分aCD3同源二聚体与双抗分子A。

图10. 采用Jurkat-NFkB-Luc细胞检测双抗产品中的同源二聚体（(a) 双抗 (BsAb) A 和aCD3 同源二聚体 (HD) 的结构；(b) T细胞活化检测示意图，该测试利用Jurkat报告基因细胞系，该细胞系经过改造可在T细胞活化时表达荧光素酶；(c) T细胞活化试验中，aCD3同源二聚体 (圆圈)能呈现典型的剂量-效应曲线，而双抗A (三角形) 无反应）

综上所述，非对称构型双抗的同源二聚体是该类型抗体产品中的一类特有且重要的产品相关杂质/变体，以及潜在关键质量属性，需要在不同研究阶段的产品和工艺开发中予以重点关注。由于不同的双抗产品可能源于不同的分子构建平台，从而可能具有显著不同的结构和理化特性，需根据目标双抗及其同源二聚体分子在结构和理化特性上的差异和测试目的选择和筛选适用的分析方法，以有效指导产品和工艺开发中该类杂质/变体的分析和质量控制。

参考文献

[1] Christian Klein, et.al. Progress in overcoming the chain association issue in bispecific heterodimeric IgG antibodies, mAbs, 4:6, 653–663; November/December 2012.

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[6] Glen Giese, et.al. Bispecific Antibody Process Development: Assembly and Purification of Knob and Hole Bispecific Antibodies. Biotechnology Progress, Volume34, Issue2, March/April 2018: 397-404.

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[8] Sijia Huang, et.al. Structural and functional characterization of MBS301, an afucosylated bispecific anti-HER2 antibody. MABS. 2018, Vol. 10, NO. 6, 864–875.

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[10] Haitao Jiang, et.al. Characterization of Bispecific Antibody Production in Cell Cultures by Unique Mixed Mode Size Exclusion Chromatography. Analytical Chemistry. 2020, 92, 13, 9312–9321.

[10] Ho Young Lee, et.al. Development of a bioassay to detect T-cell-activating impurities for T-cell-dependent bispecific antibodies. SCIENTIFIC REPORTS. 2019, 9:3900.

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