求助！分光光度计测蛋白浓度法

偏锋

公司要求用分光光度计检验新到抗体浓度是否达标。用的如下公式，其中稀释因子为稀释倍数。



但我实际使用抗体进行分光光度检测时，发现好像与这个公式不符，数据如下图。原溶液是15mg/ml，红框标示出来的为按稀释倍数等比换算的，红框右侧为按分光光度及上述公式计算所得。 总体出入偏大。



然后我又用BSA（牛血清蛋白）配制成1、2、3、4、5mg/ml的标准溶液，在280nm下建立标准基线。 标准曲线建立完后我用BSA溶液又测了一下，标准曲线是准的。
但是我使用上述0.75mg/ml的抗体溶液进行检测时，按标准曲线所得浓度为32mg/ml。


请问各位前辈大佬，我应该是在哪个位置出现离纰漏？或者说我应该如何检测蛋白浓度呢？

偏锋

如图，这是刚刚没显示出的图

偏锋

这是我们公司前辈给的公式

ljychg@163.com

蛋白质或多肽的显色反应对人员操作要求比较高，尽量快速准确的操作；
另外供试品溶液的稀释浓度最好在曲线中间点附近，你说的0.75mg/ml，比曲线最低浓度还低，已经不在曲线测定范围内了。
具体情况要具体分析，从你的描述中，暂时只能想到这些。

预感

我对紫外也不太清楚，过来学习一下

kmyind

有干扰？是不是有带键的保护剂之类的玩意吧

yhgz

多谢分享！

拐角1

你0.75mg/ml的吸光度值测下来是多少

偏锋

拐角1 发表于 2024-10-31 08:42
你0.75mg/ml的吸光度值测下来是多少

280nm下是0.968,
260nm下是0.59

落幕灬

BSA我们以前是用Lowry法测的，挺准的，曲线0.999以上，残差平方和也符合要求；一般有误差就是有干扰物质在或者ph的问题

偏锋

落幕灬 发表于 2024-10-31 10:48
BSA我们以前是用Lowry法测的，挺准的，曲线0.999以上，残差平方和也符合要求；一般有误差就是有干扰物质在 ...

不行啊，我们公司来的抗体一般一次也就1~2ml。抗体测完是需要回收使用的。

宋云飞

1）蛋白质在280 nm处有特征吸收峰，主要由色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）残基引起。

计算公式（以IgG为例）：

浓度 (mg/mL)=A280/ε

其中，IgG 的消光系数ε≈1.4（即1mg/mL 抗体溶液A280≈1.4），因此：[IgG]≈ A280/1.4

2）DNA/RNA 在 260 nm 有强吸收，且其A260/A280 比值较高（DNA ≈ 1.8，RNA ≈ 2.0）。若样品中混有核酸，会抬高A280（因光谱重叠），导致蛋白浓度被高估。

查看 A260/A280 比值：

纯 IgG：A260/A280 比值 ≈ 0.6–0.7，若 > 0.8，提示核酸污染

校正公式（Warburg-Christian 公式）：[Protein] (mg/mL)=(1.55×A280）-（0.76×A260)

（适用于IgG类抗体）

可以问一下你们抗体供货商是怎么测浓度的。不同方法会有差异。

​

3）关于BSA做标准对照

A280 的消光系数 ε（1 mg/mL 溶液） 牛血清白蛋白（BSA）≈0.66–0.67免疫球蛋白G（IgG）≈1.35–1.40

即：1 mg/mL BSA 的A280≈0.66；1 mg/mL IgG 的A280≈1.4

误将 IgG 当作 BSA 计算 高估超过2倍（约偏高112% ）。