HPLC法测伏立康唑的血药浓度

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       伏立康唑是广谱三唑类抗真菌药，已成为侵袭性曲霉菌 病的首选药物〔1〕。伏立康唑的代谢受多种因素的影响，包括 遗传变异，年龄，性别，饮食因素，合并症，多种药物，肝功能和 肾功能等。所有这些因素最终导致伏立康唑血药浓度的变化。已有研究表明，伏立康唑的浓度与剂量依赖性的药效和毒性有关，因此对伏立康唑进行治疗药物监测是必需的〔2〕。 本文旨在建立的快速、简便、稳定的 HPLC 分析方法来分析血 浆中伏立康唑的药物浓度，以此为临床设计伏立康唑个体化给药方案提供依据。

1 材料

1. 1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪( 安捷伦科技( 中 国) 有限公司) ; CPA225D 型电子天平( 赛多利斯科学仪器( 北 京) 有限公司) ; XW-80A 型旋涡混合器( 上海精科实业有限公司) ; H1650 型医用离心机( 湖南湘仪实验室仪器开发有限公 司) ; TDZ4-WS 低速自动平衡离心机( 上海卢湘仪离心机仪器 有限公司) 。

1. 2 药品和试剂伏立康唑对照品( 纯度 99. 8% ，中国食品药 品检定研究院) ，内标卡马西平( 纯度 99. 7% ，中国食品药品 检定研究院) ，其余试剂均为分析纯; 试验用水为纯水。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件

       色谱柱: Agilent technologies ZOＲBAX SB-C18 色谱柱( 150 × 4. 6mm，5μm) 。流动相: 甲醇∶ 水 = 53∶ 47，等度 洗脱，流速 1. 0mL·min － 1 ，柱温: 30℃，检测波长: 256nm，进样 量 30μL。

2. 2 标准品溶液的配制

       精密称取伏立康唑标准品 25. 0mg 于 25mL 容量瓶中，以少量甲醇溶解后加甲醇∶ 水为 1∶ 1 的溶 液稀释至刻度，充分混匀，得 1mg·mL － 1 标准储备液，置于 4℃冰箱备用。

2. 3 内标溶液的配制

       准确称取卡马西平标准品 5. 0mg 于 50mL 容量瓶中，以少量甲醇溶解后加甲醇∶ 水( 1∶1) 的溶液稀 释至刻度，充分混匀，得 0. 1mg·mL － 1 内标储备液，置于 4℃冰箱备用。

2. 4 血样处理

       准确吸取血浆样本 200μL 于 2mL 离心管， 加入 20μL 内标工作液，加 入 乙 腈 300μL，旋 涡 离 心 1min， 14000r·min － 1 离心 5min，取上清液进样。

2. 5 方法专属性

       取对照品溶液和内标溶液直接进样; 另取 空白血浆和服药后患者的血浆，分别按“2. 4”项下方法处理 并测定，记录色谱图，结果( 见图 1) 。在本文色谱条件下，待 测物峰形良好，分离完全，且血浆中内源性物质不干扰测定。

2. 6 线性关系考察

       精密吸取对照品贮备液适量，加入空白血浆样品，配制成伏立康唑含量分别 为 0. 31、0. 62、1. 24、 2. 48、4. 96、9. 92、19. 84μg·mL － 1的模拟血浆样品，按“2. 4” 项下条件处理进样分析，以伏立康唑的浓度( X) 为横坐标，伏立康唑峰面积与内标峰面积比值为纵坐标( Y) 回归分析，得 回归方程为: Y = 11. 2956X + 0. 04457( Ｒ2 = 0. 99959，n = 7) 。 结果表明伏立康唑浓度在 0. 31 ～ 19. 84μg·mL － 1范围内，呈 良好的线性关系。定量下限可达 0. 31μg·mL － 1( S /N≥10) 。

2. 7 回收率实验

       配制伏立康唑 0. 31、0. 74、2. 22、6. 67μg· mL － 1线性范围内四个水平的模拟血浆样品各 5 份，按“2. 4” 项下方法处理后进行色谱分析，以“2. 6”所得曲线计算实际测定浓度，将其与理论浓度比较分析方法回收率，结果( 见表 1) 。

2. 8 精密度试验

       同回收率测定方法，配 制 0. 31、0. 74、 2. 22、6. 67μg·mL － 1 线性范围内四个水平的模拟血浆样品， 按“2. 4”项方法操作分析，一日内不同时间 5 次，连续操作 3 日测定，考察方法精密度，结果( 见表 1) 。

2. 9 稳定性试验

       配制 0. 31、0. 74、2. 22、6. 67μg·mL － 1线 性范围内三个水平的模拟血浆样品分别在常温和反复冻融情 况下储存，按“2. 4”项下操作，考察其稳定性。血浆样品室温 放置 4h 内稳定( ＲSD≤7. 12% ) ，血浆样品 － 20℃ 放置经过 3 次反复冻融后稳定( ＲSD≤6. 48% )

2. 10 方法学应用

       本方法应用于我院 26 例使用伏立康唑 预防和治疗的重症患者血药谷浓度监测，给药方法为首剂 0. 4g，之后0. 2g q12h 静脉滴注，将1 ～ 5μg·mL － 1 定义为有效 浓度，其中谷浓度低于 1μg·mL － 1 的患者 4 例，浓度在 1 ～ 5μg·mL － 1 的 9 例，浓度高于 5μg·mL － 1 的 9 例。

3 讨论

3. 1 流动相体系的选择

       文献报道〔3，4〕伏立康唑 HPLC 的检 测流动相多选用乙腈-磷酸盐缓冲液体系，但我们发现，以磷酸盐缓冲体系作为流动相，配制复杂，色谱柱柱压较高，色谱柱易堵塞，样品分析后需对仪器进行长时间的清洗，工作繁琐，且乙腈的成本较高。本实验对流动相进行了优化，选用甲醇-水体系，以甲醇∶ 水 = 53∶47 为流动相，伏立康唑峰形对称， 目标峰可与杂质峰分离完全，保留时间稳定 10. 2min，方法简单，且成本低，适合临床大批量样本分析应用。

3. 2 样品处理方法的选择

       本文分别比较了固相萃取小柱法，有机溶剂萃取法和乙腈蛋白沉淀法来处理样品，发现使用固相萃取小柱法方法繁琐，耗时较长，成本也较高，不适用于大批量样品检测; 有机溶剂萃取法操作过程也较长，系统误差 大，且要用到乙酸乙酯，二氯甲烷及乙醚等有毒液体，对操作人员健康不利; 乙腈蛋白沉淀法文献报道使用 2. 5 倍血浆样 品体积的乙腈作为蛋白沉淀剂，但是本实验发现，使用过多的蛋白沉淀剂对样品稀释大，检测信号低，检测限难以达到临床 分析要求。最终选定了 1. 5 倍血浆样品体积的乙腈作为蛋白 沉淀剂，结果表明，该方法可以有效去除血浆中的蛋白质，样品提取回收率较高。

3. 3 26例患者分析

       本实验测定的 26 例患者伏立康唑均使用相同的剂量， 伏立康唑的谷浓度差异很大，有 4 例患者低于有效浓度，9 例 患者高于有效浓度。越来越多的研究证明其临床疗效及肝毒性、神经毒性等不良反应与血药浓度直接相关〔6，7〕。据报道 监测伏立康唑水平大大减少了由于不良事件引起的停药〔8〕。 因此，我们应密切关注患者伏立康唑的血药浓度，通过监测其 谷浓度及时调整用药方案以实现给药的个体化，保证临床疗效和减少不良反应。

4 结论

       综上，本实验建立的 HPLC 测定伏立康唑血药浓度的方 法快速、简便、稳定，可用于临床大批量伏立康唑浓度的测定， 同时对伏立康唑给药方案的调整，实施个体化给药，确保临床 用药安全、有效有一定的指导作用。

参考文献

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〔2〕Ashbee HI，Barnes ＲA，Johnson EM，et al. Therapeutic drug monitoring ( TDM) of antifungal agents: Guideline from the British society for medical mycology〔J〕. J Antimicrob Chemother，2014，69 ( 5) : 1162- 1176.

〔3〕鲁虹，史群志，李玲 . 基于伏立康唑血药浓度监测的药物相互作 用研究〔J〕. 中国抗生素杂志，2019，( 7) : 864-867.

〔4〕Johnson H J，Han K，Capitano B，et al. Voriconazole Pharmacokinetics in Liver Transplant Ｒecipients〔J〕. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2010，54( 2) : 852-859.

〔5〕程振宇，王焕锋 . 高效液相色谱法测定血浆中伏立康唑浓度的方 法及应用〔J〕. 现代诊断与治疗，2017，( 10) : 77-80.

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