课程问答 | 碱裂解纯化技术在mRNA疫苗放大生产中的应用

小鹏1

Q&A | 碱裂解纯化技术在mRNA疫苗放大生产中的应用

分离与纯化，更简单！

2022年4月18日，BLA系列课程第一期：《碱裂解纯化技术在mRNA疫苗放大生产中的应用》，邀请利穗科技（苏州）有限公司 高级产品经理金博闻授课，利穗科技针对课程中收集的问题予以解答，供大家学习和探讨。

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Q1：请再详细解释一下气吹得到下清液？

A1：一般醋酸钾和SDS氢氧化钠的碱性溶液混合，加上之前裂解出来的物质，在接触酸液后会迅速析出絮状物。 气吹方式可以转移，促进酸碱中和和带走热量。 清液为富含RNA和DNA的混合溶液。

Q2：CIP的要点？

A2：系统管路和层析设备一样，自清洗加泡碱。盘管用CIP泵清洗。

Q3：质粒纯化整套工艺内毒素的最主要控制点在哪里？低产质粒会导致内毒素去除难度增大吗？

A3：用阴离子除内毒素是比较通用的纯化工艺。低产质粒建议中间增加超滤浓缩步骤，否则纯化效率较低。

Q4：在线混合结束后，如何排空?

A4：低点排空和冲洗置换。

Q5：请问纯化过程用到的中空纤维柱和层析柱有单独的耗材产品吗？

A5：利穗不提供耗材，但是有合作的进口耗材供应商，可以帮助联系推荐。

Q6：裂解过程RNA去除哪个方法最有效，可去除多少？

A6：分子筛或者部分新复合填料（oligoDT,core 700等，疏水+排阻+亲和一步完成）。

Q7：请问PPT中碱裂解工艺步骤您这边优化了哪些参数？是否用DoE的方法？

A7：主要裂解的时间，大肠杆菌裂解环境，剪切力和效率的控制。使得几个关键参数处于GMP要求的数据记录中，更符合工业生产。

Q8：设备可以做成一次性的嘛？怎么通过盘管计算混匀时间？搅拌是怎么实现的呢？内部工作原理流程能不能细讲一下？

A8：可以做成PP管路的，适配CDMO或多种产品的客户。混匀时间是流速和换液能力的计算，搅拌是管道+腔体搅拌共同实现。内部原理可以加利穗销售和产品部门详细沟通。苏州纳米园有DEMO样机可以直接进行实验。

Q9：现在业界做的最好的rna残留是多少？有对比过使用手动操作的方式与贵司的连续裂解法的rna残留的差异吗？

A9：最好数据不清楚，但是大多做到了小于2%。 有做过对比手动裂解的实验，大多数收获率提高50-80%。

Q10：裂解的不完全会导致HCD和内毒增加吗？

A10：痕量和内毒素不是裂解不完全导致的。

Q11：在碱裂解中和过程中，会有一些絮状沉淀生成，会堵塞盘管吗，如果盘管用的是软管，在盘旋的过程中，是否有变形的可能，导致有效运行体积变小，碱裂解时间不足的情况？

A11：不会堵塞，有一定的线流速和气吹装置专门用于解决此问题。不存在变形问题，因为我们是硬管，体积不变。

Q12：裂解及中和一般用什么溶液？浓度是大概是多少？设备与其接触位置的耐受性如何？是否会涉及溶出？

A12：醋酸，醋酸钾较为常见。我们做过常见酸液和盐溶液的不锈钢浸泡实验。溶出物问题基本可以忽略。可以给出具体酸溶液，我们提供实验数据。

Q13：裂解那个设备，里面都是盘管吗，物料走盘管里吗？

A13：碱液和物料会通过盘管。

Q14：pH计探头一般为玻璃的，不耐碱，会发生反应，怎么避免这种情况？

A14：清洗和保存时可以拆下来，有快拆设计。

Q15：如果不是一次性的，又有多个质粒品种，那么就是通过反复碱性洗吗？

A15：对，反复冲洗。

Q16：200L发酵收集菌体8kg是否太少了，8kg菌体重悬液80KG，碱液加中和液是按照1：1配置，这个是不是有点出入呢，中和后澄清前采用气顶是吗？

A16：这个只是一个举例数据，大多数客户的菌泥体积，200L发酵在8-20KG之间。这个参数重要程度不如质粒含量。中和后气吹方式，可以满足混合，低剪切，带走热量和帮助分层的作用。

Q17：质粒是做什么用途的？

A17：mRNA疫苗用到病毒和质粒载体，此设备用于质粒的获得。

Q18：一般盘管多长？

A18：20-50米都有，看具体计算

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