关于菌株的复苏和传代，讨教一下

qq56953

菌种复苏与传代方法——金黄色葡萄球菌（暂定）

0代：冻干菌种

第1代（复壮）：用75%的酒精擦拭消毒后的，用无菌方法把容器（装菌株的）打开。用吸管吸取相适宜的液体培养基（胰酪大豆胨液体 培养基TSB ） 1ml 加到容器中，转动容器使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。用吸管将容器内菌液全部转移到相应的液体培养基管15ml中。贴好标签，放入培养箱，在相应的温度（30〜35°C），时间（18〜 24h）下进行培养，观察，浑浊说明菌种生长。

第2代（复壮）：1.吸取经复苏后的细菌菌液 1ml，加到相适宜的液体培养基管（ 胰酪大豆胨液体 培养基TSB ）15ml中，制备2管，贴好标签，在相应的温度（30〜 35°C），时间（18〜24h）下进行培养，对菌种进行复壮。

2.取上述其中一管，用无菌接种环接种培养物到 平皿与 试管斜面（平皿和斜面都为 胰酪大豆胨琼脂培养基TSA），温度（30〜35°C），时间（18〜 24h）培养。

3.取另一管，跟等体积含20%的无菌甘油（24ml纯化水+6ml甘油）混匀，以1支2ml分装于冻存管，对最后一支进行相应的确认。

第3代：平皿（S3）用于传代 、 试管斜面（W3）用于工作

注：平皿划线培养的纯化菌株可传代（S3）

以上是借鉴@katy  回答写的，请各位帮眼看看是不是大概流程就这样，那我现在工作用的菌株是应该从试管斜面（W3）挑取之后在TSB里培养成W4（第四代）后再稀释成菌悬液使用吗？

补充内容 (2020-4-22 15:44):
笔误：第1代（复苏）

运际

你的方案里没有分离。我的做法是：0代--1代，用营养琼脂，1--2代，挑选单菌落到TSB,2代培养液离心加甘油保存（2代数量有限），另外一部分2代继续接到TSB做工作菌株，加甘油保存，以后做无菌试验接阳性的时候用这个3代。但是不知道一支3代可不可以用多次，还是只能用一次

三十而立12

0代开菌培养，建立主种子库，由主种子库区1支开菌培养，建立工作种子库，要使用时，直接在工作种子库中领取就可以了

qq56953

三十而立12 发表于 2020-4-22 15:36
0代开菌培养，建立主种子库，由主种子库区1支开菌培养，建立工作种子库，要使用时，直接在工作种子库中领取 ...

那请问一下 主种子库是“复苏后的液体培养基和等体积的20%无菌甘油混合冻存吗？”，然后取一支 按第2代后的步骤，冻存为工作种子库？  所以主种子库应该是1代，工作种子库是2代对吧

三十而立12

qq56953 发表于 2020-4-22 15:48
那请问一下 主种子库是“复苏后的液体培养基和等体积的20%无菌甘油混合冻存吗？”，然后取一支 按第2代后 ...

关于冻存问题，这个方法很多，根据各个公司的具体要求进行，我们是用的脱脂牛奶冻干保存，也用离心收集菌体加甘油冻存的。购买回来的菌种称0代，工作种子算2代，严格地讲每转传一次，都要增加一个代次，在建立主种子库时，如果开菌培养后，需要转传几次，那么转传几次就算几代，就是说有可能是三代、四代菌建立的朱种子库，这个在行业内工艺核查的时候，都会作为重点进行检查

qq56953

三十而立12 发表于 2020-4-23 11:25
关于冻存问题，这个方法很多，根据各个公司的具体要求进行，我们是用的脱脂牛奶冻干保存，也用离心收集菌 ...

好的谢谢，我试试用20%无菌甘油试试可不可行，保存有效的话再上来建议

qq56953

运际 发表于 2020-12-2 22:36
你的方案里没有分离。我的做法是：0代--1代，用营养琼脂，1--2代，挑选单菌落到TSB,2代培养液离心加甘油保 ...

说得很对，后面我也是重新想了一下这个问题，增加上去了，不过没来这里更新