无菌隔离器偏差求助

飞翔的火锅

五批不锈钢片芽孢指示剂条（后文简称为BI）检测过程见下表，前三次空载，后两次满载，第三次满载未开展。

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批次	指示剂送检编号	试验时间	培养时间	备注
1	A1~A19	2019.10.14  16:20（空载1）	2019.10.14      16:53	所有编号培养基观察澄清，未长菌。
2	B1~B19	2019.10.14  16:20（空载2）	2019.10.14      16:53	2019.10.17  15:10发现编号B11的培养基出现浑浊，已长菌。
3	C1~C19	2019.10.15    15:21（空载3）	2019.10.15      15:58	所有编号培养基观察澄清，未长菌。
4	D1~D19	2019.10.15    15:21（满载1）	2019.10.15      15:58	所有编号培养基观察澄清，未长菌。
5	E1~E19	2019.10.16    16:09（满载2）	2019.10.16      16:44	2019.10.18  16:10发现编号E9的培养基出现浑浊，已长菌。

根据偏差描述的问题及情况，从鱼骨图中人、机、料、法、环、测六个方面推测找出可能的原因，其次逐一对可能的原因进行分析并确定根因。

从人的角度进行分析：

1、是否为人员取出BI过程中，BI受到污染？

人员从冰箱取出BI到张贴到无菌隔离器腔体中都是佩带无菌手套进行操作，而且对长菌的B11、E9的培养基进行疑似菌的测序鉴定，鉴定结果都是只含有嗜热脂肪地芽孢杆菌，如果是取出过程中受到污染可能会有多种微生物，故人员取出BI过程中，BI受到污染可能性较低。

2、是否人员未按照BI使用方法张贴，导致BI未完全受到灭菌？

BI按照BI使用方法张贴，将BI撕开口处的纸片成90°折贴，垂直张贴在内腔表面。故人员错误摆放BI，导致BI未完全受到灭菌可能性较低。

从设备的角度进行分析：

灭菌运行过程各阶段及作用

①     预处理阶段，这个阶段，将压缩空气经过囊式过滤器过滤后注入主腔体，运行一段时间，以达到除湿的效果。过氧化氢加热器进行预热。

②     充气阶段，过氧化氢溶液通过蠕动泵按照一定的速率滴入蒸发器产生灭菌蒸汽，灭菌蒸汽将会通过循环风机进风注入到主腔体中。从主腔体流回的过氧化氢蒸汽通过回风道到静压箱再回到主腔体中，形成一个封闭的循环。

③     灭菌阶段，在这个阶段，设备的运行状态与充气阶段的相同，唯一的区别就在于过氧化氢可以会以较低的速度注入。灭菌阶段目的是为了让灭菌蒸汽均匀分布在腔体内，增加了灭菌汽体与灭菌环境的接触时间，使灭菌更为充分。

④     通风阶段，这个阶段，主腔体内的空气与过氧化氢蒸汽通过催化分解支路循环。过氧化氢蒸汽经过二氧化锰过滤器后被分解成水蒸气和氧气。

1、是否为H2O2蒸发器失效？

H2O2蒸发器温度在操作屏上显示160℃左右，当30%H2O2溶液通过蠕动泵注入到加热盘中闪蒸为气态H2O2，通过循环风机扩散到腔体内。如果是H2O2加热盘失效会导致腔内H2O2浓度的下降，但是整个确认过程中没有出现设备H2O2蒸发器报警，H2O2浓度曲线也是平稳的没有异常现象，且H2O2蒸发器温度传感器经过计量在确认有效期内，故不是设备H2O2蒸发器失效导致。

2、是否为蠕动泵故障或H2O2管道堵塞？

	第一次	第二次	第三次	第四次	第五次
充气阶段前H2O2 重量	2070g	1718g	1362g	1585g	1230g
灭菌阶段后    H2O2 重量	1731g	1376g	1020g	1243g	887g
H2O2消耗重量	340g	342g	342g	342g	343g

由上表可知五次灭菌过程中H2O2消耗量都在340g左右，最大和最小值相差不超过1%；如果是蠕动泵故障或H2O2管道堵塞，则会导致腔内H2O2浓度的下降，但是H2O2浓度浓度值没有出现异常情况，设备内部的台秤也经过计量,在计量有效期内故不是蠕动泵故障或H2O2管道堵塞。

3、是否为H2O2浓度传感器测量值不准？

三次小试使用经计量过离线 H2O2浓度传感器（见附件7）测腔内回风通道附近测出的浓度值与设备显示屏上显示的值差距较小见下表，但第一次、第二次与第三次结果值相差很大，经咨询厂家工程师，温度低、湿度高时探头滤膜上容易形成液滴导致堵塞，探头测出的H2O2浓度值比真实值偏低。无菌隔离器H2O2浓度传感器是安装在循环高效上方，30%H2O2溶液通过蠕动泵按照一定的速率滴入蒸发器产生灭菌蒸汽，灭菌蒸汽将会通过循环风机进风注入到主腔体中。从主腔体流回的H2O2蒸汽通过回风道到静压箱再回到主腔体中，形成一个封闭的循环。综上由于探头滤膜表面容易形成液滴，导致测定值不准确。故不是H2O2浓度传感器测量值不准导致灭菌不合格可能性较小。

	第一次	第二次	第三次
设备显示主腔体灭菌阶段开始浓度	189.2ppm	208.8ppm	302.6ppm
离线探头显示主腔体灭菌阶段开始浓度	180ppm	200ppm	295ppm

4、是否为灭菌运行参数设置不合理？

5次灭菌过程中各次预处理阶段前、后主腔内的温湿度与灭菌阶段显示器上显示主腔体内的平均H2O2浓度见表1

整个阶段时间	第一次    2019.10.14    09:20~12:01		第二次2019.10.14    12:28~15:08		第三次2019.10.15    09:54~13:18		第四次2019.10.16    09:47~12:56		第五次2019.10.16    13:09~15:51
预处理前温湿度	22.3℃	63.7%	24.9℃	61.0%	21.4℃	64.1%	22.6℃	67.0%	26.3℃	59.1%
预处理后温湿度	22.6℃	58.2%	25.4℃	55.8%	21.7℃	58.5%	22.9℃	60.4%	26.8℃	54.1%
主腔H2O2浓度	164.4ppm		235.9ppm		156.4ppm		171.1ppm		247.2ppm
结果	合格		不合格		合格		合格		不合格

表1五次灭菌过程数据

5次灭菌过程第二次和第五次出现了BI灭菌不合格情况，且主腔H2O2平均浓度值比其它3次高的原因是温度低、湿度高时探头滤膜上容易形成液滴导致堵塞，探头测出的H2O2浓度值比真实值偏低。经咨询设备厂家工程师，BI灭菌结果并不是单独以H2O2浓度值来判定，而是由多种综合因素引起的（灭菌温度、灭菌浓度和灭菌时间），这两次灭菌不合格情况主要是由于灭菌时间偏短引起的。且USP 40< 1229.11>Vapor PhaseSterilization（气体灭菌）中说明online monitoring of vapor phaseconcentration is not widely utized as a control parameter（气体浓度在线监测并没被作为一个主要的控制参数广泛的应用）。

厂家工程师对设备各灭菌阶段的主要时间参数进行了修改（见表2），对充气阶段时间和灭菌阶段时间进行了延长，让灭菌效果更明显。

项目	更改前参数	更改后参数
预处理时间（min）	10	20
充气时间（min）	15	20
灭菌时间（min）	30	45
通风时间（min）	90	75

表2五次灭菌过程数据

在2019.11.30~2019.12.01开展了三次小试，灭菌结果均合格  3次小试灭菌过程中各次预处理阶段前、后主腔内的温湿度与灭菌阶段显示器上显示主腔体内的平均H2O2浓度见表3

整个阶段时间	第一次    2019.10.14    11:48~14:38		第二次2019.10.14    08:36~11:30		第三次2019.10.14    11:46~14:38
预处理前温湿度	22.6℃	64.8%	22.9℃	64.8%	26.8℃	58.5%
预处理后温湿度	23.5℃	53.7%	24.0℃	52.4%	28.0℃	49.8%
主腔H2O2浓度	212.2ppm		226.7ppm		290.3ppm

表3三次小试灭菌过程数据

由表1可得知整个预处理阶段时间设定为10min时，主腔体内温度上升0.5℃左右，湿度下降5%左右。

由表3可得知整个预处理阶段时间设定为20min时，主腔体内温度上升1.0℃左右，湿度下降10%左右。

根据物理学中的气体分子运动理论：湿度越低温度越高，气体分子的运动越剧烈。

通过表1和表3的数据，判断出预处理阶段时间越长，设备内部温度就会越高、湿度越低，利于气态H2O2扩散，设备内部各个角落可以更充分的进行灭菌。

故灭菌运行参数设置不合理可能性较大。

5、是否为灭菌过程中主腔体出现泄漏？

灭菌当天均进行了泄漏测试，从100 Pa开始下降，保压3分钟后腔体压力均高于76 Pa。泄漏率：≤0.5%/h，测试结果合格。且灭菌阶段过程中使用经计量过的H2O2低浓度探头（50114874）（见附件11）对房间进行H2O2浓度检测，数值为零。

故灭菌过程中主腔体出现泄漏可能性较低。

从物料的角度进行分析：

1、是否为BI过期？

AH-39批次BI有效期至2020.04.30，故不是BI过期。

2、是否为BI孢子数偏高？

AH-39批次BI公司内部验收合格，孢子数在正常范围内，故不是BI孢子数偏高。

3、是否为BI存储条件不合格？

AH-39批次BI是供应商通过冷链运输到公司仓库，从公司仓库领取到第一化验室也是包裹着冰袋，在化验室也是一直存放在2~8℃的冰箱（50025019）在设备有效期内（见附件13）中，故不是BI存储条件不合格。

从方法的角度进行分析：

1、是否为BI布点不合理？

本次验证布点原则遵循均匀分布且尽可能找最差点，偏差中9号和11号点分别是主腔前右下角和主腔前手套内（从左往右第二个），都符合最差点条件，故不是BI布点不合理。

左右传递窗BI张贴位置图（括号中数字是右传递窗摆放位置编号）                         主腔BI张贴位置图

BI摆放位置见下表

摆放编号	摆放位置	摆放编号	摆放位置
1	左传递窗后左上角	11	主腔前手套内（从左往右第二个）
2	左传递窗后右上角	12	主腔操作台面左侧
3	左传递窗前左下角	13	主腔操作台面右侧
4	左传递窗前右下角	14	回收桶内
5	左传递窗手套内	15	右传递窗后左上角
6	主腔后右上角	16	右传递窗后右上角
7	主腔后左上角	17	右传递窗前左下角
8	主腔前左下角	18	右传递窗前右下角
9	主腔前右下角	19	右传递窗手套内
10	主腔后手套内（从左往右第三个）

从检测的角度进行分析：

1、是否为培养BI的方法不符合操作规程规定？

5次培养过程中，BI消毒后经传递窗进入到检测间，检测用具和BI再次消毒后进入到生物安全柜内培养。说明书要求检测（生物安全柜保护下，用无菌镊子将生物指示剂逐一取出，分别放置含4ml大豆酪蛋白水解培养基的试管中，置56~60℃的培养箱中进行培养），置56~60℃的培养箱中进行培养7天，且5个批次的阳性样品培养基浑浊，阴性对照培养基澄清，故不是培养指示剂的方法不符合操作规程规定。

2、是否为生物安全柜和培养箱没有经过设备确认？

生物安全柜均在设备确认有效期内，故不是生物安全柜和培养箱没有经过设备确认。

综上所述，导致该偏差发生的最大可能原因：

1、厂家工程师设定的设备灭菌运行参数不合理，导致灭菌阶段时腔内芽BI内的孢子未全灭活。

辅料

真的是你弄的越详细我就越想仔细看，哈哈！其实也不算太乱，各个方面都评估了，有异议的地方就是“经咨询设备厂家工程师，BI灭菌结果并不是单独以H2O2浓度值来判定，而是由多种综合因素引起的（灭菌温度、灭菌浓度和灭菌时间），这两次灭菌不合格情况主要是由于灭菌时间偏短引起的。”这句话有点自相矛盾了，前面说是由多种综合因素引起的，后面怎么就一下断定是灭菌时间短造成的呢？我才猜测可能就是不知道真正原因就多灭一会，肯定能合格。其实作为一般的偏差处理，采取延长灭菌的保守方式来纠错也是能够被接受的。但是你问了怎么确定是灭菌时间偏短，我觉得你是想找到真正的根本原因，那咱们就可以互相探讨了，我觉得直接就断定是灭菌时间偏短有点武断了，因为虽然有两次不合格，但是还有三次是合格对不对？为什么不是堵塞的探头监测不准造成的呢？这种情况就需要你去做探究性的偏差重现，还是短的灭菌时间，保证湿度合格在进行灭菌，看是否还有芽孢杆不合格的？如果还有那可能是灭菌时间短，要是没有了那可能就是其他原因了，所以偏差重现是可以继续探究的，当然了看你想走到哪一步？领导支持到哪一步了。

令狐瓜子

每个厂家隔离器参数可能都不同，有的调试的是100ppm以上维持时间4个小时，有的是150ppm，6000s，这个还要根据腔体的温湿度来定，具体还是要看设备的原理（干式或者湿式）和调试参数的化学和生物指示剂结果

飞翔的火锅

这是指示剂点位分布图

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飞翔的火锅

写的太乱了，问下怎么确定灭菌时间偏短

飞翔的火锅

辅料 发表于 2019-12-18 13:24
真的是你弄的越详细我就越想仔细看，哈哈！其实也不算太乱，各个方面都评估了，有异议的地方就是“经咨询设 ...

经咨询设备厂家工程师，BI灭菌结果并不是单独以H2O2浓度值来判定，而是由多种综合因素引起的（灭菌温度、灭菌浓度和灭菌时间）。厂家工程师表示设备灭菌浓度已无法提升，灭菌温度也是恒定的处于室温状态，而且URS提及到尽量缩短灭菌时间，厂家为了缩短整个灭菌过程的时间将灭菌阶段时间设置的较低，所以这两次灭菌不合格情况主要是由于灭菌时间偏短引起的。
探究性的偏差重现想做但没没时间。。。项目太赶了

飞翔的火锅

辅料 发表于 2019-12-18 13:24
真的是你弄的越详细我就越想仔细看，哈哈！其实也不算太乱，各个方面都评估了，有异议的地方就是“经咨询设 ...

灭菌过程第二次和第五次出现了BI灭菌不合格情况，经咨询设备厂家工程师主腔H2O2平均浓度值比其它3次高的原因是温度低、湿度高时探头滤膜上容易形成液滴导致堵塞，探头测出的H2O2浓度值比真实值偏低。URS 022提及到尽量缩短灭菌时间，为了尽可能缩短整个灭菌过程的时间提高无菌隔离器的周转率，对灭菌各阶段的处理时间进行优化（见表2），所以将灭菌阶段时间设置的较短，这两次灭菌不合格情况主要是由于灭菌时间偏短引起的。厂家工程师对设备各灭菌阶段的主要时间参数进行了修改（见表2），对充气阶段时间和灭菌阶段时间进行了延长，减少雾化现象，让灭菌效果更明显。
我最后改成这样了

Mascotte

没看完，调查的很详细，加油

lpkiqsc

我居然认真看完了，写得很详细了

令狐瓜子

写的很详细，分析的也很到位，不错，偏差如果想重现很麻烦，分析的原因整改后通过验证就ok了

令狐瓜子

飞翔的火锅 发表于 2019-12-21 18:51
这是指示剂点位分布图

图画的很牛，请问这是什么软件画的？

令狐瓜子

我做隔离器初次的话如果不合格，多数都是灭菌配方调试不合适

飞翔的火锅

令狐瓜子 发表于 2019-12-22 22:11
图画的很牛，请问这是什么软件画的？

SolidWorks

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飞翔的火锅

令狐瓜子 发表于 2019-12-22 22:12
我做隔离器初次的话如果不合格，多数都是灭菌配方调试不合适

问下您做的隔离器的浓度和时间是多少啊？设备是否有空气加热功能（除湿）

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长期使用的名字

感謝分享

吴楠1

辅料 发表于 2019-12-18 13:24
真的是你弄的越详细我就越想仔细看，哈哈！其实也不算太乱，各个方面都评估了，有异议的地方就是“经咨询设备厂家工程师，BI灭菌结果并不是单独以H2O2浓度值来判定，而是由多种综合因素引起的（灭菌温度、灭菌浓度和灭菌时间），这两次灭菌不合格情况主要是由于灭菌时间偏短引起的。”这句话有点自相矛盾了，前面说是由多种综合因素引起的，后面怎么就一下断定是灭菌时间短造成的呢？我才猜测可能就是不知道真正原因就多灭一会，肯定能合格。其实作为一般的偏差处理，采取延长灭菌的保守方式来纠错也是能够被接受的。但是你问了怎么确定是灭菌时间偏短，我觉得你是想找到真正的根本原因，那咱们就可以互相探讨了，我觉得直接就断定是灭菌时间偏短有点武断了，因为虽然有两次不合格，但是还有三次是合格对不对？为什么不是堵塞的探头监测不准造成的呢？这种情况就需要你去做探究性的偏差重现，还是短的灭菌时间，保证湿度合格在进行灭菌，看是否还有芽孢杆不合格的？如果还有那可能是灭菌时间短，要是没有了那可能就是其他原因了，所以偏差重现是可以继续探究的，当然了看你想走到哪一步？领导支持到哪一步了。

完全赞同。这是Cycle Development 没做好。
另外CI的测试结果如何？
在失败的那些点，CI的结果通过吗？

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巨子

隔离器的CDP也就是一个摸参数的过程，而且这些参数通常都会打出富余量，如果在CDP的时候BI就出现这种情况（尽管是在满载的情况下做的）。我觉得对于以后的检验生产还是有很大风险的。要么重新做CDP试试？

飞翔的火锅

吴楠1 发表于 2020-03-10 12:08
完全赞同。这是Cycle Development 没做好。
另外CI的测试结果如何？
在失败的那些点，CI的结果通过吗？

浓度不到200ppm，变色都很差，现在延长灭菌时间，调整灭菌参数后浓度上升至300ppm，CI变色好很多了。美国USP1229.11 online monitoring of vapor phase concentration is not widely utilized as a control parameter 浓度只作为参考，偏向于BI结果

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飞翔的火锅

巨子 发表于 2020-03-10 12:29
隔离器的CDP也就是一个摸参数的过程，而且这些参数通常都会打出富余量，如果在CDP的时候BI就出现这种情况（尽管是在满载的情况下做的）。我觉得对于以后的检验生产还是有很大风险的。要么重新做CDP试试？

领导认为有必要做我才能做

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入门酱油

我感觉没有验证根本原因，还是有一定的风险。