OneShine™CRISPR/Cas9基因敲除细胞文库

wangsheng0726

OneShine™CRISPR/Cas9基因敲除细胞文库

一、原理

Lenti-CRISPR V2质粒图谱如上所示。gRNA与Cas9蛋白结合于同一个载体上。我们设计合成了12万个gRNA（靶向约2万个基因），分别连接到Lenti-CRISPR V2载体上，然后把12万个质粒混合起来，形成CRISPR/Cas9 基因敲除质粒文库。并且我们将此文库整合到了细胞中，一个125cm2细胞培养瓶中含有约10^8个细胞，每个细胞被敲除了一个基因，共约2万个基因被敲除，所以含有每个特定基因缺陷的细胞约有5000个（10^8/2万）。拿到细胞后，可进行传代。

二、参数

靶基因物种：人

靶基因数目：19,050

gRNA数目： 123,411

细胞类型：胃癌、乳腺癌、结肠癌等癌细胞系和永生化的细胞系。

价格：7万元/株

三、应用

【应用举例：细胞凋亡相关基因筛选】

取细胞文库进行扩增，然后平均分成两份，每一份包含10^8个细胞，每个细胞被敲除了一个基因，共约2万个基因被敲除，所以含有每个特定基因缺陷的细胞约有5000个（10^8/2万）。向其中一份细胞中加入放线菌素D、诱导细胞凋亡（A组），在另一份细胞中加入溶剂、作为对照（B组）。A组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞A1、未凋亡细胞A2，B组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞B1、未凋亡细胞B2。分别对A1、A2、B1、B2进行短测序，检测哪些基因被敲除了。A2中被敲除的基因具有抗凋亡作用，B1中被敲除的基因具有促进凋亡的作用。其它应用：

（1）新药靶点确定与验证

（2）环状RNA上游调控机制分析

（3）Long noncoding RNA作用机制验证

（4）脂肪代谢机制研究

（5）干细胞自我更新、不对称性分裂机制等。

syhorchid

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